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世界华人消化杂志. 2006-09-08; 14(25): 2556-2559
在线出版日期: 2006-09-08. doi: 10.11569/wcjd.v14.i25.2556
血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性与肝硬化的关系
黄玉波, 董庆鸣, 宋淑静, 魏红山, 刘志英, 成军, 毛羽
黄玉波, 董庆鸣, 宋淑静, 魏红山, 刘志英, 成军, 毛羽, 北京地坛医院 北京市 100011
基金项目: 北京市优秀人才培养专项经费资助课题, No. 20041D0301548.
通讯作者: 魏红山, 100011, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. drliver@163.com
电话: 010-64211031-2359
收稿日期: 2006-05-15
修回日期: 2006-05-26
接受日期: 2006-06-08
在线出版日期: 2006-09-08

目的: 建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)法检测血管紧张素ⅡⅠ型受体基因(AT1R) A1166C位点的多态性.

方法: 对50例血清抗HBs阳性的健康对照者及46例HBV感染后肝硬化患者的血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性的多态性进行分析. 根据血管紧张素ⅡⅠ型受体基因设计引物, 在A1166C位设计DdeⅠ酶切位点, 根据PCR产物酶切结果判断该位点为A或C.

结果: 两株纯合子与AT1R序列同源性在99%以上, 并在A1166C位点出现预期变异; 肝炎和肝硬化两组间A1166C位点无论是基因型还是等位基因均无显著性差异(P>0.05).

结论: PCR-RFLP的方法可用于AT1R基因A1166C位点基因多态性的检测, 该位点的变异尚未显示其与肝纤维化有关.

关键词: 多聚酶链式反应; 限制性片段长度多态性分析; 纤维化; 血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素Ⅱ受体
引文著录: 黄玉波, 董庆鸣, 宋淑静, 魏红山, 刘志英, 成军, 毛羽. 血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性与肝硬化的关系. 世界华人消化杂志 2006; 14(25): 2556-2559
A1166C polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene and its role in pathogenesis in liver cirrhosis
Yu-Bo Huang, Qing-Ming Dong, Shu-Jing Song, Hong-Shan Wei, Zhi-Ying Liu, Jun Cheng, Yu Mao
Yu-Bo Huang, Qing-Ming Dong, Shu-Jing Song, Hong-Shan Wei, Zhi-Ying Liu, Jun Cheng, Yu Mao, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China
Correspondence to: Dr. Hong-Shan Wei, Institute of Infectious Disease, Beijing Ditan Hospital, 13 Ditan Park, Anwai Street, Dongcheng District, Beijing 100011, China. drliver@163.com
Received: May 15, 2006
Revised: May 26, 2006
Accepted: June 8, 2006
Published online: September 8, 2006

AIM: To establish a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method to detect A1166C polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) gene.

METHODS: A1166C polymorphism was detected and analyzed in 50 anti-HBs positive healthy controls in the serum and 46 patients with liver cirrhosis after hepatitis B virus infection. A set of primers was designed according to AT1R gene. The enzyme digestion site for restriction endonuclease DdeⅠwas also designed around A1166C. A or C allele was assured based on the enzymatic result of the polymerase chain reaction products.

RESULTS: Sequencing revealed 99% homogeneity between the two homozygous strains and the AT1R gene. The anticipated mutations appeared at position A1166C. As for genotype or allele, there were no significant differences at position A1166C between the hepatitis group and the liver cirrhosis group (P > 0.05).

CONCLUSION: The established method can be applied to detect the A1166C polymorphism of AT1R gene. The mutation at A1166C site has no correlation with liver fibrosis.

Key Words: Polymerase chain reaction; Restriction fragment length polymorphism; Fibrosis; Angiotensin Ⅱ; Angiotensin Ⅱ type 1 receptor
0 引言

血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rennin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)中调节血管收缩、维持血容量的主要效应分子, 血管紧张素Ⅱ受体(angiotensinⅡreceptor, ATR)介导AngⅡ的生理学效应, 他分为AT1R和AT2R两种亚型, 主要发挥生物学效应的是AT1R, 是RAAS作用的关键环节. 目前, 关于AT1R基因多态性的研究较多, 其中A1166C位点是一个重要位点. 1994年, Bonnardeaux et al[1]首先描述了A1166C变异, 部分学者认为CC基因型与高血压有关[2-5], 但是其他研究者持不同态度[6-10]. 目前还认为A1166C与动脉粥样硬化[11]、左心室肥大[7,12]、冠心病[13]有关. 近年研究发现AT1R及其mRNA的高表达与肝纤维化有关[14-15]. 那么A1166C位点的变异与肝纤维化是否有关呢? 目前, 国内外尚未有报道. 为此, 我们建立了多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)检测A1166C位点的变异并探讨其在肝纤维化中的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

收集2004-06/12北京地坛医院住院的抗HBs抗体阳性的对照者血清标本50份, 男女各25例, 年龄36±4.1岁. 肝硬化血清标本46份, 男女各23例, 年龄43±6.3岁. 病例的诊断标准符合2000年西安第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案》. Taq聚合酶为上海生工生物工程公司产品, 100 bp DNA ladder和DdeⅠ内切酶为Promega公司产品, PCR仪为ABI公司9700型. 质粒提取采用Sigma公司GenElute Plasmid Miniprep Kit. 根据A1166C位点位于2个引物之间设计引物, 由北京赛百盛公司合成. 引物序列如下: P1: 5'-GATAATGTAAGCTCATCCACCA-3'; P2: 5'-AATGTGGCTTTGCTTTGTCTTG-3'. 扩增产物为257 bp.

1.2 方法

外周血白细胞基因组的提取: 采用华美生物工程公司ReadyPCRTM全血基因组DNA纯化系统, 严格按照试剂盒说明书操作. PCR反应体系: PCR系统含10×缓冲液3 μL, 25 mmol/L dNTPs 0.4 μL, 25 μmol/L P1和P2各0.5 μL, Taq聚合酶2 U, 血细胞提取物4 μL, 反应总体积为30 μL. 循环条件: 94 ℃预热3 min, 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环, 最后, 72 ℃延伸7 min. 取扩增产物8 μL经30 g/L琼脂糖凝胶(含1 mg/L EB)电泳, 在 257 bp处出现荧光带者为阳性. PCR产物酶切: DdeⅠ酶切位点为C'TNAG, 如果A1166C位点为C, 则产生DdeⅠ酶切位点, 如果为A, 则酶切失败. 取PCR产物8.5 μL, 10×缓冲液D 1 μL, DdeⅠ 0.5 μL (5 U), 37 ℃酶切16 h. 取酶切产物10 μL经30 g/L琼脂糖凝胶电泳, 只在257 bp处出现条带者为AA纯合子, 在140 bp和117 bp处出现条带者为CC纯合子, 在以上3个位置均有条带者AC杂合子. PCR产物的分子克隆与测序: 分别取AA纯合子(命名为DT-A1166)和CC纯合子(命名为DT-1166C)的PCR产物, 用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化, 直接与T-easy载体连接, 转化XL-1-Blue细菌, PCR筛选阳性克隆, 提取质粒, 采用通用引物, 经双脱氧链末端终止法进行双向测序(由上海生工生物工程公司完成). DNA序列资料采用Vector NTI 9.0软件包及GeneDoc 2.6分析.

统计学处理 SPSS 10.0软件包, 计数资料组间差异采用χ2检验分析, P<0.05认为组间有显著差异.

2 结果
2.1 PCR产物酶切电泳

分别取AA纯合子、AC杂合子和CC纯合子阳性标本DdeⅠ酶切产物各2份经30 g/L琼脂糖凝胶电泳, 结果与预期相符(图1).

图1
图1 A1166C PCR扩增产物DdeⅠ酶切电泳结果. M: 100 bp DNA ladder; 1, 2: AA纯合子; 3, 4: AC杂合子; 5, 6: CC纯合子.
2.2 PCR产物克隆测序

将DT-A1166, DT-1166C和AT1R基因(GenBank注册号: D13814)相应序列进行比对发现, DT-A1166确为AA纯合子, DT-1166C确为CC纯合子, 序列同源性在99%以上(图2).

图2
图2 PCR产物克隆测序比较结果.
2.3 肝病和肝硬化A1166C位点基因多态性

肝炎(恢复期)和肝硬化标本A1166C位点基因多态性检测结果见表1, 所有标本均未检出CC纯合子. 两组间无论是基因型还是等位基因均无显著性差异(P>0.05).

表1 肝炎和肝硬化A1166C位点基因多态性比较结果 (n/%).
基因型肝炎 (恢复期)肝硬化
AA45 (90.0)44 (95.7)
AC5 (10.0)2 (4.3)
A等位基因50 (90.9)46 (95.8)
C等位基因5 (9.1)2 (4.2)
3 讨论

AT1R基因位于第3号染色体长臂2区1-5带上(3q21-q25). 人类只有单一的AT1R基因, 他的编码区只有1个外显子, 无内含子, 有1个开放读码框, 全长1080 bp. AT1R含有359个氨基酸残基, 属于G蛋白家族成员, 并与牛、大鼠的氨基酸顺序高度一致. AT1R是RAAS的重要组成部分, 除了对心血管系统的调节作用, 在心、肾间质纤维化及肝纤维化中的作用也越来越受到重视. 有学者发现AT1R与鼠胰腺的纤维化有关[16]. AT1R的拮抗剂也可以减轻心脏的纤维化[17]. 目前已有动物实验研究表明, 大鼠的肝星形细胞(HSC)存在AT1R, 并经测序得到证实, 而且用AT1R拮抗剂治疗肝大鼠纤维化取得了明显的疗效[18].

肝纤维化形成过程中, HSC的激活和增生, 尤其是HSC表型的激活是肝纤维化形成过程的关键. 近来研究表明, RAAS参与了HSC的激活过程. Wei et al[19]证明了肝纤维化形成时醛固酮合成酶基因-CYP11B2 mRNA在HSC中表达增强, 醛固酮拮抗剂安体舒通对早期肝纤维化具有抑制作用, 同时发现了肝脏激活的HSC表达AT-1受体. 提示AngⅡ及其受体AT1R在HSC的激活和转化过程中可能具有重要的作用. Lim et al[20]用AT-1受体拮抗剂Losartan治疗肥厚性心肌病大鼠, 取得明显疗效, Ⅰ型胶原及转化生长因子-β (TGF-β) mRNA表达均减少了50%以上. Yoshiji et al[21]新近发现AT-1受体拮抗剂Candesartan可减轻大鼠肝纤维化, 降低肝纤维化血清标志物和 TGF-β mRNA等表达水平.

现有结果显示AT1R可能与肝纤维化有关, 但AT1R的A1166C位点多态性是否与肝纤维化有关, 国内外尚无类似研究资料. 我们建立了PCR-RFLP检测AT1R基因A1166C位点的变异, 经过测序证实该方法准确可靠, 可以用于该位点多态性的检测. 但是, 目前尚不明确是否A1166→C的变异会影响RAAS的活性. A1166C位于AT1R的3'非翻译区, 不可能直接影响mRNA的稳定性, 可能是与一种影响AT1R转录、翻译或影响mRNA的稳定性的蛋白因子基因存在共分离的结果[1]. 本文对50例肝炎和46例肝硬化外周血基因组中AT1R基因A1166C位点基因多态性检测尚未显示其与肝纤维化有关, 究竟该位点的多态性是否会影响RAAS的活性, 还需扩大样本量进行更进一步的深入研究.

评论
背景资料

组织局部肾素-血管紧张素系统的激活导致肝硬化发生. 血管紧张素原启动子多态性与肝纤维化发生密切相关, 但血管紧张素ⅡⅠ型受体的基因多态性与肝硬化之间关系的资料比较缺乏.

同行评价

血管紧张素Ⅱ作为一种细胞因子在肝纤维化发生学方面起重要的作用. 本文作者探讨肝炎和肝硬化患者血管紧张素ⅡⅠ型受体基因(AT1R) A1166C位点的多态性与肝纤维化的关系是肝纤维化发生学的热点课题, 因而具有科学意义.

电编:张敏 编辑:潘伯荣

1.  Bonnardeaux A, Davies E, Jeunemaitre X, Fery I, Charru A, Clauser E, Tiret L, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension. Hypertension. 1994;24:63-69.  [PubMed]  [DOI]
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