A型肉毒毒素腹腔注射对大鼠小肠通过速度及胆碱酯酶和P物质表达的影响

摘要

目的: 研究A型肉毒毒素(botulinum toxin A, BTA)腹腔注射(ip)对大鼠小肠通过速度及胆碱酯酶(AChE)和P物质(substance P, SP)表达的影响. 

方法: 8周龄Wistar♂大鼠24只随机分为A, B, C, D4组, 每组6只; A, B, C组分别ip含BTA 4, 2, 1 U的生理盐水2 mL, D组为对照组, ip生理盐水2 mL. 4 wk后行小肠碳沫推进实验, 取回肠末段标本行免疫组织化学染色对比AChE及SP的表达. 

结果: A, B组大鼠的小肠碳沫推进百分比(分别为53.9%±4.0%和53.2%±3.0%)小于D组(66.4%±5.6%; P<0.05), 但C组(64.3%±5.6%)与D组无统计学差异; A, B组AChE和SP在回肠肌层及黏膜层表达减少, 整合光密度与D组相比差异显著(肌层AChE: 99.3±39.3, 76.3±36.4 vs 260.1±114.8, P<0.05; 黏膜层AChE: 224.6±85.4, 230.1±120.7 vs 230.1±120.7, P<0.05; 肌层SP: 161.2±90.6, 200.7±65.5 vs 355.9±70.9, P<0.05; 黏膜层SP: 198.6±60.3, 229.7±71.8 vs 412.5±79.2, P<0.05), C组与D组无统计学差别(P>0.05).

结论:  BTA ip能减慢大鼠的小肠碳沫推进速度, 减少回肠末段AChE和SP的表达.

关键词: A型肉毒毒素; 小肠通过速度; 胆碱酯酶; P物质; 大鼠

Effects of intraperitoneal injection of botulinum toxin A on passage velocity in small intestine and expression of acetylcholinesterase and substance P in rats

Hui Han, Qing-Sen Liu, Wen-Hui Liu

Hui Han, Department of Emergency, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Qing-Sen Liu, Wen-Hui Liu, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Correspondence to: Hui Han, Department of Emergency, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China. hanh301@163.com

Received: March 9, 2006
Revised: March 20, 2006
Accepted: April 6, 2006
Published online: May 18, 2006

Abstract

AIM: To investigate the effects on small intestinal passage velocity and expression of acetylcholinesterase (AChE) and substance P in rats by injection of botulinum toxin A (BTA) intraperitoneally.

METHODS: Twenty-four Wistar rats of 8 weeks were randomly and averagely divided into 4 groups. The rats in group A, B and C were intraperitoneally injected with 4, 2, and 1 U BTA containing in 2 mL normal saline, while those in group D were treatment with the same amount of normal saline (2 mL). Charcoal suspension pushing test of small intestine and immunohistochemistry of AChE and Substance P in the end ileum were performed 4 wk after injection.

RESULTS: The propelling rate of charcoal suspension at the end of 4 weeks in small intestine was significantly lower in group A (53.9% ± 4.0%) and B (53.2% ± 3.0%) in comparison with that in group D (66.4% ± 5.6%)(P < 0.05). There was no marked difference between group C (64.3% ± 5.6%) and D. The expression of AChE and SP were decreased after injection and the integrated optical density were notably lower in group A and B than those in group D (muscular AChE: 99.3 ± 39.3, 76.3 ± 36.4 vs 260.1 ± 114.8, P < 0.05; mucosal AChE: 224.6 ± 85.4, 230.1 ± 120.7 vs 230.1 ± 120.7, P < 0.05; muscular SP: 161.2 ± 90.6, 200.7 ± 65.5 vs 355.9 ± 70.9, P < 0.05; mucosal SP: 198.6 ± 60.3, 229.7 ± 71.8 vs 412.5 ± 79.2, P < 0.05). There were no significant differences between group C and D (P > 0.05).

CONCLUSION: Intraperitoneal injection of BTA can decrease the passage velocity in small intestine and the expression of AChE and SP in rats.

Key Words: Botulinum Toxin A; Small Intestinal Passage Velocity; Acetylcholinesterase; Substance P; Rats

0 引言

BTA能阻碍神经肌肉接头处乙酰胆碱(ACh)的释放, 导致肌肉瘫痪或张力降低, 目前已经广泛用于肌痉挛[1]、多汗症[2]等疾病以及贲门失弛缓症等消化道张力过强性疾病. 随着研究的深入, 还发现BTA能减慢实验动物胃的排空[3]抑制幽门结扎刺激引起的胃酸分泌[4], 也能抑制其他内脏的收缩[5], 但目前的应用主要是局部注射, 为研究全身应用BTA是否影响小肠通过速度及其可能的机制, 我们以大鼠为模型通过ip BTA进行了实验研究. 

1 材料和方法

1.1 材料

BTA由兰州生物制品研究所提供, 商品名称: 衡力, 110 U/支; 10 g/L水合氯醛, 解放军总医院制剂室提供; 出生8 wk Wistar♂大鼠24只, 由解放军总医院实验动物中心提供; 即用型ASBC免疫组化试剂盒、兔抗大鼠乙酰胆碱酯酶、兔抗大鼠P物质(武汉博士德公司); DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、苏木素溶液(北京中山公司).

1.2 方法

大鼠随机分为4组, 每组6只. A, B, C组分别ip含BTA 4, 2, 1 U的生理盐水2 mL; D组为正常对照, ip生理盐水2 mL. 给药后动物分笼独立饲养, 自由进食、饮水; 饲养4 wk后行小肠碳沫推进实验: 自制100 g/L碳沫按10 mL/kg灌胃后放回饲养笼活动20 min; 给予水合氯醛按4 mL/kg体质量腹腔注射麻醉, 麻醉至深昏迷后立即解剖, 从幽门分离全小肠至回盲部, 将小肠平直铺于洁净玻璃板上, 测全小肠长度及碳沫推进最远端距离幽门的长度. 取距回盲部10 cm回肠标本常规固定、包埋行AChE及SP免疫组织化学染色. AChE, SP染色的每张切片按肌层及黏膜层分别随机选取2个视野, 照相; 用计算机病理图文分析系统进行分析, 选取整合光密度(integrated optical density, IOD)值、阳性总面积、面积比(阳性面积与视野总面积比)进行半定量分析, IOD值越大表明染色越强, 总面积或面积比越大表明染色阳性神经元越多. 碳沫在小肠内推进的百分比=碳沫推进最远端距离幽门的长度/全小肠长度×100%.

统计学处理: 数据结果采用平均数±标准差(mean±SD)描述, 统计方法采用t检验、以P<0.05为差异显著, 有统计学意义.

2 结果

2.1 小肠碳沫推进实验结果

在给药后各组动物均耐受良好, 无明显喘息、竖毛、活动减少等BTA中毒的表现, 解剖时见腹腔内清洁, 无积液、肠管狭窄、扩张等. A, B, C组动物小肠长度(分别为106.66±3.07 cm, 114.50±9.50 cm, 110.66±11.51cm)与D组(109.83±6.58 cm)相比无统计学差异. A, B组大鼠小肠碳沫推进百分比(分别为53. 9%±4.0%和53.2%±3.0%)低于对照组D组(66.4%±5.6%, P<0.05). 但C组(64.3%±5.6%)与D组相比无统计学差别.

2.2 肠道AChE

肠道AChE在肠道肌层及黏膜、黏膜下层均有分布, 但以肠肌间神经丛和黏膜下丛分布最为集中, 染色阳性部位局限于细胞质. 黏膜层AChE阳性部位沿腺体排列. 经计算机病理图文分析系统分析, 回肠黏膜层与肌层AChE染色结果除A, B组黏膜层IOD值与D组相比无统计学差异外, 其余各指标均有统计学差异, 表明A, B组AChE的表达较对照组减少, 但黏膜层仅AChE的表达面积减少, 强度无统计学差别(表1).

表1 回肠AChE阳性细胞表达的半定量分析 (mean±SD).

分组	回肠肌层			回肠黏膜层
	总面积	面积比	IOD	总面积	面积比	IOD
A	52209±24762a	0.099±0.032a	99.3±39.3a	86410±26346a	0.119±0.0350a	224.6±85.4
B	21905±7716a	0.070±0.030a	76.3±36.4a	128453±36725a	0.110±0.036a	230.1±120.7
C	99429±52824	0.232±0.057	178.1±68.7	232913±71522	0.192±0.024	290.5±67.6
D	127932±35846	0.184±0.047	260.1±114.8	260198±110721	0.231±0.086	375.4±138.4

^aP<0.05 vs 对照组.

2.3 肠道SP细胞

肠道SP阳性细胞分布于在肠道肌层及黏膜层, 黏膜下层亦有分布, 但以肠肌间神经丛分布最为集中, 染色阳性部位局限于细胞质. 黏膜层SP阳性部位主要在上皮层, 沿腺体排列. 肌层阳性表达主要分布于肠肌间神经丛部位(表2).

表2 回肠SP阳性细胞表达的半定量分析 (mean±SD).

分组	回肠肌层			回肠黏膜层
	总面积	面积比	IOD	总面积	面积比	IOD
A	45872±10589b	0.085±0.067b	161.2±90.6b	95267±15964b	0.101±0.041b	198.6±60.3b
B	51687±17984b	0.104±0.048b	200.7±65.5b	110689±17284b	0.129±0.068b	229.7±71.8b
C	77358±21059	0.150±0.061	291.1±50.4	154275±34469	0.184±0.095	297.6±80.2b
D	90542±19265	0.186±0.068	355.9±70.9	185261±62359	0.221±0.057	412.5±79.2

^bP<0.05 vs 对照组.

3 讨论

肉毒毒素是已知最强的生物毒素之一, 是肉毒梭菌在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素, 属于一种高分了蛋白的神经毒素, 能引起人和动物的肉毒中毒. 其引起中毒的机制是作用于神经肌肉接头抑制胆碱能神经释放乙酰胆碱. 根据毒素抗原的不同, 将其分为A, B, C, D, E, F, G 7型, C型中尚有C1和C2两个亚型、其中A型的结构、功能己较清楚并且已经应用于贲门失弛缓、奥狄括约肌痉挛、肛裂等肌肉张力过高性疾病. 胃肠运动受肠神经系统(ENS)、中枢神经系统以及体液因子的调节. 内脏敏感性增高、ENS和脑肠互动的变化是胃肠疾病特别是功能性胃肠病中受重视的因素. ENS在调节胃肠运动中起重要作用, 含多种神经元. 除分泌经典神经递质的乙酰胆碱能神经元和肾上腺素能神经元外, 还有分泌SP等多种肽能神经. 胆碱能神经释放的ACh可引起小肠运动增强、回盲瓣括约肌松弛, 是决定胃肠运动的重要组成部分, 其功能日益受到研究者的重视. ACh主要是由AChE水解而失活. AChE是ACh的水解酶, 显示AChE是公认的显示ACh的方法, AChE活性增强则代表ACh释放增加, 胆碱能神经兴奋性增高[6]. 我们的实验发现, BTA能减少回肠肌层ACh的释放; 对于黏膜层可减少表达面积, 但对强度无统计学影响, 这可能是样本数较少的缘故, 是否由于BTA促进AChE阳性细胞凋亡引起面积减少尚需进一步研究. 因此, 理论上可以认为, 肉毒毒素可以由于减少肠道ACh的释放而减弱肠道运动, 尽管局部注射已经广泛用于消化道局部张力过强性疾病, 但由于肠道长达数米且肠易激综合征(IBS)、功能性腹痛等与肠道动力异常相关性疾病的动力异常并非局限于某一段肠管, 局部注射BTA治疗这类疾病并不现实, 并且也有学者报道在结、直肠切除、回肠肛管吻合术后狗实验发现, 回肠囊内局部注射BTA并不能改变排便频率[7].

SP是哺乳类动物重要的脑肠肽之一, 广泛分布于中枢、周围神经系统、胃肠道各层及胃肠少量肠内分泌细胞[8]. 分布于胃肠道的SP能神经胞体存在于肠肌间神经丛内, 发出的纤维分布至肠壁各层, 其末稍释放的SP能抑制胃酸的分泌,刺激胃蛋白酶的分泌、促进小肠水和电解质分泌以及胃肠平滑肌的收缩[9]. 是肠道的兴奋性递质[10]. SP不仅是生理状态下的神经递质, 而且与多种病理状态相关, 目前多数学者报道了IBS以及其他胃肠道疾病患者肠道SP表达增加或受体上调[11-13]. 尽管有不同的报道[14], 一般认为, 与腹泻有关的疾病中SP含量升高, 兴奋纵行和环行平滑肌, 加强结肠的集团推进运动, 可致排便次数增加, 而便秘的病人则主要表现为SP的减低[10,15].

我们的实验提示, BTA可以减少肠道SP的表达, 其机制可能是由于SP与ACh在囊泡内共存[16]. SP的降低可能有助于缓解肠源性疼痛, 在动物实验已经发现, BTA能减轻福尔马林诱发的疼痛[17]. 因此, 本实验提示除通过ACh作用外, BTA可能通过减少SP减弱肠道的运动和分泌, 也可能有助于改善内脏高敏性, 增强抗伤害感受能力, 提示BTA对功能亢进性胃肠疾病可能有治疗作用.

总之, BTA对小肠运动具有抑制作用, 我们通过全身应用BTA发现, 腹腔注射确实能减慢大鼠的小肠传输速度. 其部分机制是减少ACh和SP的释放.

评论

背景资料

BTA最早用于斜视的治疗, 目前已经广泛用于消化道张力过强性疾病、肌痉挛、多汗症、神经源性膀胱、美容矫形学等多领域, 其抗伤害感受作用(antinociceptive)是近年研究的热点, 在动物实验中已经发现与P物质、降钙素基因相关肽等有关, 在人体的研究尚少. 虽然有人尝试用小量静脉给药来治疗帕金森氏病的全身性肌张力障碍, 但目前的应用主要是局部注射, 并且先前的报道多是以骨骼肌为研究对象, 全身应用对消化系统的作用尚属空白.

创新盘点

本文以平滑肌为研究对象, 证实了全身应用BTA对小肠通过速度存在影响, 初步探讨了其可能的机制.

应用要点

本文实验为治疗功能亢进性疾病如腹泻、腹痛等提供了新的思路, 随着靶向治疗技术的发展, 应用BTA选择性的治疗胃肠疾病将成为可能, 由于其作用时间长, 将为患者提供更多的便利.

备注

电编:李琪 编辑:潘伯荣

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