基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2006. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2006-04-28; 14(12): 1172-1177
在线出版日期: 2006-04-28. doi: 10.11569/wcjd.v14.i12.1172
RNA干扰抑制HepG2-N10细胞系中HBV基因表达及复制
潘金水, 任建林, 程通, 董菁, 黄松洁, 施华秀
潘金水, 任建林, 董菁, 施华秀, 厦门大学附属中山医院消化内科 福建省厦门市 361004
程通, 福建省分子医学病毒研究中心, 厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 福建省厦门市 361004
黄松洁, 厦门大学附属中山医院厦门市临床检验中心 福建省厦门市 361004
潘金水, 在读硕士研究生, 厦门大学附属中山医院消化内科主治医师, 主要从事消化道肿瘤分子生物学研究.
通讯作者: 任建林, 361004, 福建省厦门市, 厦门大学附属中山医院消化内科. jianlinr@msn.com
电话: 0592-2292017 传真:0592-2292017
收稿日期: 2006-02-22
修回日期: 2006-03-01
接受日期: 2006-03-15
在线出版日期: 2006-04-28

目的: 评估以U6启动子作为启动序列(pSilencer2.0-U6)载体介导的小RNA干扰片段在培养细胞株中抑制HBV复制的效应.

方法: 将针对HBV基因组不同区域(S, X及C区)的核苷酸序列插入至pSilencer载体中, 并将重组后的pSilencer质粒(分别为pS, pX及pC)载体转染入HepG2-N10细胞株(可稳定表达HBsAg、HBeAg及adw2亚型Dane颗粒)中. 以ELISA法检测病毒抗原, 以逆转录-聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测病毒mRNA, 并以荧光定量PCR法检测分泌入培养基的共价闭合环状DNA(covalent closed circular DNA, cccDNA).

结果: 质粒载体介导的RNA干扰能明显抑制培养基中HBsAg及HBeAg的表达. 并且RT-PCR法检测显示病毒mRNA也被降解了, 从而减少了蛋白表达及病毒逆转录复制的模板. 荧光定量PCR法检测显示分泌入培养基的cccDNAs明显下降(HBV DNA log10: pS: 4.00±0.13; pC: 4.08±0.10; pX: 4.28±0.06; pN: 5.05±0.07; HepG2-N10: 4.74±0.06; HepG2: <2.70).

结论: RNA干扰能抑制HBV基因表达及病毒复制, 并且RNA干扰可能为HBV的治疗带来巨大的变化.

关键词: 乙肝病毒; RNA干扰; 病毒复制
引文著录: 潘金水, 任建林, 程通, 董菁, 黄松洁, 施华秀. RNA干扰抑制HepG2-N10细胞系中HBV基因表达及复制. 世界华人消化杂志 2006; 14(12): 1172-1177
RNA interference inhibits hepatitis B virus gene expression and replication in HepG2-N10 cells
Jin-Shui Pan, Jian-Lin Ren, Tong Cheng, Jing Dong, Song-Jie Huang, Hua-Xiu Shi
Jin-Shui Pan, Jian-Lin Ren, Jing Dong, Hua-Xiu Shi, Department of Gastroenterology, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China
Tong Cheng, Fujian Research Center of Medical Molecular Virology, Key Laboratory of Cell Biology and Tumor Cell Engineering of Ministry of Education, Xiamen University, Xiamen 361002, Fujian Province, China
Song-Jie Huang, Xiamen Center of Clinical Laboratory, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China
Correspondence to: Professor Jian-Lin Ren, Department of Gastroenterology, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China. jianlinr@msn.com
Received: February 22, 2006
Revised: March 1, 2006
Accepted: March 15, 2006
Published online: April 28, 2006

AIM: To evaluate the effect of vector-based small interfering RNA promoted by U6 (pSilencer2.0-U6) on the inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication in HepG2-N10 cells.

METHODS: Several sequences targeting on different regions of HBV genome were inserted into pSilencer vectors. The expression plasmids were then transfected into HepG2-N10 cells, a cell line which stably expressed HBsAg, HBeAg and adw2 subtype Dane Particles. Viral antigens were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Viral mRNA was analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The covalent closed circular DNA (cccDNA) secreted into the culture media were measured by quantitative real-time PCR.

RESULTS: Vector-based RNA interference potently reduced HBsAg and HBeAg expression in cell culture. Furthermore, RT-PCR analysis showed that viral mRNAs were effectively degraded, thus eliminating the messengers for protein expression as well as templates for reverse transcription. Quantitative Real-time PCR analysis of cccDNAs revealed that vector-based RNA interference inhibited HBV replication efficiently (HBV DNA log10: pS: 4.00 ± 0.13; pC: 4.08 ± 0.10; pX: 4.28 ± 0.06; pN: 5.05 ± 0.07; HepG2-N10: 4.74 ± 0.06; HepG2: <2.70).

CONCLUSION: RNA interference can inhibit HBV gene expression and virus replication.

Key Words: Hepatitis B Virus; RNA interference; Virus replication
0 引言

HBV可导致急慢性肝炎及肝细胞癌. 目前全球范围内约3.5亿人携带有HBV, 而其中每年约有100万死于HBV感染的慢性并发症, 如肝硬化、肝癌或两者并存[1]. 虽然目前已有预防用疫苗供应, 但是对于慢性感染者的治疗选择仍然有限. 研究表明, 拉米夫啶治疗1年后能出现病毒学及生化反应[2-3]. 然而, 多数研究表明, 继续治疗每年约有20%患者产生耐药现象[4]. α-干扰素及聚乙醇化干扰素抗病毒效应也较强, 但停药后应答持续时间较短[5-6]. 阿迪福韦治疗144 wk后能取得病毒复制抑制、酶学正常及组织学反应改善等益处. 然而, 常出现耐药突变现象[7]. 因此, 必须寻找可供替代的现症感染治疗方法. RNA干扰是双链RNA引发同源mRNA降解这一现象[8]. 在过去应用于打断由HIV-1、肝炎病毒、流感病毒等引起的疾病过程[9-12]. 业已证明, 在体外试验中将小干扰片段或干扰片段表达盒导入细胞中能抑制HBV基因表达及病毒复制[10-11]. 这些结果表明高效率转染的小干扰片段可能将有效地抑制慢性感染患者中HBV的复制. 然而, 多数这类研究先在体外合成干扰片段, 然后将其转染入细胞内. 体内转运、血浆中稳定性低及细胞摄取率低仍是目前最主要的困难[13-14]. 为了解决这些问题, 学者们在质粒[15-17]或病毒载体[18-20]基础上建立了几个哺乳动物源性表达载体. 我们建立了以U6启动子启动的质粒表达载体(pSilencer 2.0-U6), 旨在观察该表达载体产生的小干扰片段能否抑制培养细胞中HBV的复制.

1 材料和方法
1.1 材料

Trizol试剂及阳离子脂质体Lipofecta-mine购自Invitrogen公司. Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清及抗生素购自Hyclone公司. DNA测序及发夹RNA (short hairpin interfering RNAs, shRNAs)合成由Invitrogen上海公司进行. 质粒pSilencer 2.0-U6由Ambion公司提供. HBsAg及HBeAg ELISA试剂盒购自厦门新创公司. RT试剂盒、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自Promega公司. HepG2-N10细胞株(承蒙福建省分子医学病毒研究中心, 厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室夏宁邵教授惠赠)能稳定表达HBsAg, HBeAg以及adw2亚型Dane颗粒, 并且HBV 4个开放读码框(open reading frame, ORF)转录的mRNA也能由RT-PCR法检测出来[21]. HepG2-N10细胞株的培养条件包括DMEM培养基, 并含有100 mL/L胎牛血清, 2 mol/L的L-谷氨酰胺, 100 mg/L青霉素及100 kU/L链霉素. 培养条件包括: 增湿的37 ℃温箱, 含有50 mL/L 的CO2. 细胞活力以台盼蓝染色排除法判断. HepG2-N10细胞在转染前24 h内铺入24孔板. 以Lipofectamine阳离子脂质体作为转染试剂, 转染后48 h收获细胞. 每种质粒分别转染3个细胞孔. 单独转染环状pSilencer阴性质粒作为阴性对照. 该阴性对照质粒能表达与任何已知的人类、小鼠及大鼠基因同源性均极低的siRNA. 每种质粒转染均重复3次.

1.2 方法

应用Ambion公司在线软件, 我们选择了3个adw2基因亚型HBV(GenBank编号: AY707087)基因位点作为靶序列, 并命名为si-HBVS, X及C. si-HBVS的靶序列位于HBV基因组的S区及P区(nt 593-611), si-HBVX的靶序列位于X区(nt 1648-1666), si-HBVC的靶序列位于C区(nt 1923-1941). 这3对完全与靶位点配对的核苷酸片段由Invitrogen上海公司合成, 序列如下: si-HBVS正义链为5'-GATCCATTGCACCTGTATTCCCATTTCAAGAGAATGGGAATACAGGTGCAATTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAATTGCACCTGTATTCCCATTCTCTTGAAATGGGAATACAGGTGCAATG-3'; si-HBVX正义链为5'-GATCCGGTCTTACATAAGAGGACTTTCAAGAGAAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTCTTACATAAGAGGACTTCTCTTGAAAGTCCTCTTATGTAAGACCG-3'; si-HBVC正义链为5'-GATCCAGAATTTGGAGCTACTGTGTTCAAGAGACACAGTAGCTCCAAATTCTTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAAGAATTTGGAGCTACTGTGTCTCTTGAACACAGTAGCTCCAAATTCTG-3'. 每条正义链分别与其反义链退火后, 可形成一个限制性核酸内切酶BamHI 及HindⅢ的黏性末端. pSilencer 2.0-U6表达质粒由供应商分别以BamHI及HindⅢ酶切处理, 形成线性化片段, 并除去酶切下来的小片段而纯化, 因此他不能发生自身连接. 按照供应商的说明, 应用T4 DNA连接酶将退火后的双链核苷酸片段插入线性化的载体. 按照说明, 将退火后的双链核苷酸片段插入pSilencer 2.0-U6载体BamHI及HindⅢ位点中. 这样, 即完成了可分别表达针对S区, X区及C区shRNA表达质粒的构建. 这3种表达质粒分别命名为pS, pX及pC. 同样地, 阴性对照质粒命名为pN. 所有构建好的质粒经Invitrogen上海公司DNA 测序后加以确认. 分泌入培养基的HBsAg及HBeAg采用ELISA诊断性试剂盒(厦门新创公司)测定, 并按试剂盒说明操作.

1.2.1 病毒RNA的RT-PCR分析: 按照供应商说明, 以Trizol试剂提取转染后细胞的总RNA. 以DNaseI消化30 min除去残存DNA, 总RNA以Trizol试剂再次提取, 离心沉淀后溶解入DEPC-水. 以oligo (dT) 18作为引物, 总RNA1.0 mg在Mu-MLV逆转录酶(Promega公司)的催化下生成互补DNA. 并使用合成的引物PCR法扩增四个开放读码框及β-肌动蛋白相应的互补. 逆转录酶经95 ℃加热5 min预灭活. PCR扩增反应体系设定为20 μL, 并含有模板2 μL, 0.18 mmol/L的dNTP混合物, 3.00 mmol/L MgCl2, 1.96 μL的10×嗜热缓冲液, 上游及下游引物各750 nmol/L. 并设立阳性对照与空白对照. 经电泳及扫描后, 所有PCR产物条带经β-肌动蛋白标化后由分析软件Gel Pro analyzer32测定. 引物信息如表1所示, PCR条件如表2所示.

表1 PCR扩增引物信息.
引物GenBank序列号引物序列
β-肌动蛋白BC023204 (nt 974-1530)上游: 5'-GGCACCACCATGTACCCT-3'
下游: 5'-CTGGGCCATTCTCCTTAGAG-3'
HBsAY707087 (nt 229-716)上游: 5'-ATCCTCACAATACCGCAGAG-3'
下游: 5'-GAAAGCCCTACGAACCACT-3'
HBcAY707087 (nt 1901-2456)上游: 5'-GCATGGACATTGACCCTTA-3'
下游: 5'-CATTGAGATTCCCGAGATTG-3'
HBxAY707087 (nt 1391-1790)上游: 5'-TACTGCCAACTGGATCCTTC-3'
下游: 5'-GCCTACAGCCTCCTAATACA-3'
表2 PCR扩增条件.
靶序列条件
β-肌动蛋白94.0 ℃ 30 s, 55.0 ℃ 30 s, 72.0 ℃ 45 s, 26循环
HBs94.0 ℃ 30 s, 52.5 ℃ 30 s, 72.0 ℃ 45 s, 28循环
HBc94.0 ℃ 30 s, 53.0 ℃ 30 s, 72.0 ℃ 50 s, 29循环
HBx94.0 ℃ 30 s, 52.5 ℃ 30 s, 72.0 ℃ 40 s, 26循环

1.2.2 HBV DNA的荧光定量PCR法测定: 分泌入培养基的共价闭合环状DNA以一个敏感的荧光定量商业试剂盒(深圳市匹基生物工程有限公司)测定. 测定下限为500×103拷贝/L. cccDNA的提取及测定在转染后2 d进行. 所有操作步骤均按说明进行. 100 μL的培养基与等量的提取液Ⅰ混合. 混合物以13000 r/min离心10 min, 在移去上清液后加入25 μL的提取液Ⅱ, 充分重悬浮沉淀物后再次以2000 r/min离心10 s, 并100 ℃水浴10 min. 当混合物经第二次13000 r/min离心10 min后, cccDNA即溶解入上清液中. 每40 μL的反应体系含有2 μL的上清液(模板). PCR扩增反应在PE Gene Amp 5700荧光PCR仪(美国Perkin-Elmer公司)上进行. PCR扩增反应程序设定为37 ℃ 5 min, 94 ℃ 1 min, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 扩增40个循环

统计学处理 HBsAg及HBeAg测定及病毒mRNA RT-PCR结果采用方差分析. HBV DNA测量值取对数后亦采用方差分析. HBV DNA测量值低于检测下限(500×103拷贝/L)的将其假定为499×103拷贝/L. 所有统计分析均采用双侧检验, 显著性水平设为0.05.

2 结果
2.1 siRNA对HBsAg表达水平的影响

为了评估HBV特异性siRNA对HBV基因表达的影响, 以诊断性ELISA试剂(厦门新创公司)于转染后48 h分别测定处理组及对照组培养基中的HBsAg水平. 经pS-Lipofectamine复合物处理48 h后HepG2-N10细胞的HBsAg表达水平较阴性对照组下降47%, 并且具有显著性差异(P<0.05). 与阴性对照组相比, 经pX-Lipofectamine及pC-Lipofectamine处理后HBsAg表达水平分别下降30%及25%(表3).

2.2 HBV特异性siRNA对HBV转录产物的影响

假定siRNA能导致特异性的靶mRNA降解, 可以预计经pS, pX及pC处理后HBV转录产物水平将下降. 相应地, HBV的mRNA表达水平采用RT-PCR法分析测定. 与经pN-Lipofectamine处理后细胞的S基因mRNA (条带5)相比, 经pS-Lipofectamine处理后同一mRNA有明显下降(条带11, 图1). HBV-mRNA水平经过同一标本的β-肌动蛋白mRNA标化处理. 与阴性对照组相比, 经pC-Lipofectamine处理后C基因mRNA表达水平下降46%, 并有显著性差异(P<0.001). 同样地, 经pX-Lipofectamine处理后相应mRNA表达水平下降47%, 亦有显著性差异(P<0.001, S-pN: 0.75±0.11; X-pN: 0.59±0.13; C-pN: 0.61±0.03; S-pS: 0.34±0.07; X-pX: 0.31±0.07; C-pC: 0.33±0.08).

图1
图1 HepG2-N10细胞mRNA表达水平(RT-PCR法). 1: Marker, 上: 0.5 kb; 2, 6, 8, 10: β-肌动蛋白; 2, 5经pN处理; 3: X基因mRNA; 4: C基因mRNA; 5: S基因mRNA; 6, 7: 经pX处理; 7: X基因mRNA; 8, 9: 经pC处理; 9: C基因mRNA; 10, 11: 经pS处理; 11: S基因mRNA.
2.3 表达质粒对HBV cccDNA的影响

HBV cccDNA的表达水平采用荧光定量PCR法测定, 该法测定下限为500×103拷贝/L. 与阴性对照组相比, 经pS, pC-Lipofectamine处理后HBV cccDNA的表达水平下降. 有趣的是, 实验中尚发现经pX-Lipofectamine处理后HBV cccDNA的表达水平下降亦达83%, 并且差别具有显著性(P<0.001, HBV DNA log10: pS: 4.00±0.13; pC: 4.08±0.10; pX: 4.28±0.06; pN: 5.05±0.07; HepG2-N10: 4.74±0.06; HepG2: <2.70).

3 讨论

虽然RNA干扰的发现仅有数年, 但是他已经成为分析基因功能及治疗肿瘤、感染性疾病及遗传性疾病的有力工具. 然而, 血浆中稳定性差、细胞摄取率低及非特异性免疫刺激对发展RNA干扰技术仍是巨大的挑战[13-14,22]. 为了克服这些困难, 设计了几种哺乳动物源性表达载体以产生内源性shRNA[15-17]. 近来, RNA干扰的体内外抗HBV效应已有报道[11,23-24]. 我们的结果表明, 载体介导的RNA干扰能显著抑制HBV抗原表达(HBsAg及HBeAg). 我们的结果还表明, 针对HBV基因组特定位点的shRNA能抑制HBV复制, 导致能稳定表达HBV的细胞株中HBV抗原的下降. 之所以选用HepG2-N10细胞株, 是因其能组成性表达HBV, 并且mRNA及相关抗原表达较为恒定. 他是个较为理想的细胞模型, 因为HBV基因组已整合入宿主基因组. 因此, 即使所有具有复制能力的中间体均被siRNA所降解, HBV的复制亦能恢复, 除非抑制作用能无限期持续下去. 在出现不可逆转的肝损伤之前清除HBV是最好方法. 然而, 清除HBV是难以实现的, 由于肝外HBV储存库的存在、HBV DNA可整合入宿主基因组中, 并且存在不需重感染即可扩增转录模板库(cccDNA)的细胞内转化途径. 因此, 停药后常伴有快速病毒反弹. 由于细胞株和自然感染株具有相同的靶序列, 因此本实验中所使用的siRNA对自然感染株可能亦有抑制作用. 然而, 对自然感染株的抑制作用能否与本实验中所观察到的抑制同等有效尚有待于进一步观察.

应用siRNA抗HBV富有吸引力, 因为HBV的mRNA有着极大的经济性, 由于其长度较小并且具有重叠读码框, 使得我们可能设计一条siRNA即可同时降解几条mRNA. si-HBVS的选择即是基于这种设想, 由于si-HBVS的靶位点同时位于HBV基因组的S区及P区. 尽管如此, 多条siRNA同时作用于HBV的不同位点发挥的抑制HBV复制作用可能比本实验所报告的单一siRNA要大. 但是, 应用这一策略发生非特异性及意料外的效应可能增加, 并导致不相关的mRNA降解(RNA干扰的"脱靶效应"[25-26]). 脱靶效应指的是与一个内源性基因某一位点并不完全同源的RNA亦能通过抑制翻译而导致基因表达的静默. G-U摆动配对可能是其主要的原因. 长度为21 nt的siRNA是达到较高的序列特异性与较低的脱靶效应的理想平衡点[27]. 在所选择的siRNA中, pS具有最强的抑制HBV复制作用. 由于pS编码产生的siRNA作用于病毒的S区, 病毒的多种mRNA均可被抑制. 除此之外, 他还能下调P基因的表达(因为S基因位于P基因内), 因此能发挥反式抑制HBV复制的作用. 这些因素可能部分解释了pS编码产生的siRNA具有最强的抑制HBV复制作用. 而且, 我们还观察到经过pX-Lipofectamine处理后的细胞株, HBV DNA的拷贝数亦有明显的下降. 这提示X蛋白可能在HBV的复制中起到重要的作用. X蛋白由X基因编码产生, 是一个小分子量蛋白质, 可能与肝细胞癌的发生[28]及病毒复制[29-30]有关. 然而, X蛋白在这两个过程中的作用机制尚有待阐明. Leupin et al[31]研究表明X蛋白刺激HBV基因组复制可能与DDB1依赖途径有关.

总之, 我们的数据表明RNA干扰是抑制HBV复制的一个令人感兴趣的新策略. 然而, 在RNA干扰上升为一个可能的治疗方法之前尚必须克服一些困难. 最大挑战是RNA干扰试剂在体内的输送. 血浆中稳定性低、跨膜摄取率差也是显著的困难. 另一问题是病毒可能产生变异体以逃避siRNA的抑制. Das et al[32]观察到在培养几周之后, HIV-1即可产生不受siRNA抑制的变异株. Wu et al[33]也在HBV中观察到类似的现象. 虽然RNA干扰现象是近来发现的, 并且存在上述的不足之处, 但是这一领域还是取得快速的突破. 越来越明确, RNA干扰是真核生物在演变过程中形成的控制基因表达及保护自身基因组免受外来入侵的高度保守的分子机制. 最新的数据表明这一古老的防御机制可以作为抗HBV及其他病毒的强有力武器. 简而言之, RNA干扰可能为HBV的治疗带来革命性的变化.

评论
背景资料

HBV携带者及慢性感染者数量众多, 但是对于慢性感染者的抗病毒治疗选择仍然有限, 且效果不尽理想. RNAi效应已经成为基因功能研究及抗病毒治疗的重要工具. 本研究设计并构建了可产生siRNA的表达质粒, 通过转染肝癌细胞系HepG2-N10, 研究其抑制HBV基因表达及病毒复制的效应.

研发前沿

应用siRNA抗HBV富有吸引力, 因为HBV的mRNA有着极大的经济性, 由于其长度较小并且具有重叠读码框. 因此应用RNAi技术抗HBV已成为RNAi抗病毒作用的研究热点.

创新盘点

多数RNAi抗HBV研究先于体外合成siRNA片段, 然后转染入宿主细胞并观察其效应. 本实验则构建能于细胞内产生siRNA的表达质粒, 将其导入细胞内观察其对HBV基因表达及病毒复制的抑制作用. 并且所采用的细胞系HepG2-N10能表达国内常见流行株的adw亚型HBV, 不同于常用的HepG22.2. 15表达的ayw亚型HBV.

应用要点

本实验构建了能产生siRNA的表达质粒, 并在DNA, mRNA及蛋白质等3个水平研究RNAi对HBV基因表达及病毒复制的抑制作用, 对发展治疗性RNAi技术进行了有益的探索.

同行评价

研究内容重要, 又有新颖性, 论证有力, 方法得当.

编辑:潘伯荣 电编:李琪

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