厚朴酚对大鼠坏死性胰腺炎肺损伤的保护作用

摘要

目的: 观察厚朴酚(magnolol, Mag)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)肺组织中核因子-κB(NF-κB)、白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响, 以探讨厚朴酚对ANP急性肺损伤的保护作用.

方法: 以50 g/L牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射制备大鼠ANP模型, SD大鼠56只随机分为假手术(SO)组, ANP模型组, 及Mag治疗组. 以荧光定量PCR检测不同时间(6, 12, 24 h)肺组织中NF-κB、TNF-α和IL-10的基因表达, 同时检测各组血清淀粉酶(Amy)的水平, 并观察胰腺和肺的组织病理学改变.

结果: 与SO组相比, ANP组肺组织中的NF-κB, TNF-α, IL-10 mRNA表达量及血清Amy显著增加(P<0.01), 其中NF-κB, TNF-α mRNA及Amy以12 h的升高最明显(P<0.01), IL-10 mRNA随ANP时间的进展表达逐渐增加(6, 12, 24 h分别为0.20±0.05, 0.27±0.07, 0.45±0.20). 与ANP各组比较, Mag各组NF-κB mRNA, TNF-α mRNA及Amy表达量下降, 也以12 h下降最显著(分别为1.30±0.14 vs 1.84±0.56, 0.41±0.19 vs 0.72±0.36, P<0.05; 104576±24886 nkat/L vs 188621±23747 nkat/L, P<0.01), IL-10 mRNA的改变无统计学意义(P>0.05). Mag治疗组肺组织学改变较ANP组明显减轻, 胰腺组织学损害无明显改善.

结论: NF-κB和TNF-α是ANP发生急性肺损伤的重要炎症因子, Mag能抑制其在ANP大鼠肺组织中的表达, 对ANP合并急性肺损伤有一定的治疗作用.

关键词: 细胞因子; 急性坏死性胰腺炎; 厚朴酚; 急性肺损伤; 大鼠

Magnolol alters cytokine response and relieves acute lung injury induced by acute necrotizing pancreatitis in rats

Zhen-Mao Li, Sheng-Xi Han, Zhi-Peng Xu, Rong-Sheng Tong

Zhen-Mao Li, Sheng-Xi Han, Zhi-Peng Xu, Department of Gastroenterology, Sichuan Provincial Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China

Rong-Sheng Tong, Department of Pharmacology, Sichuan Provincial Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China

Correspondence to: Dr. Zhen-Mao Li, Department of Gastroenterology, Sichuan Provincial Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China. lizm131@yahoo.com.cn

Received: February 13, 2006
Revised: March 1, 2006
Accepted: March 3, 2006
Published online: April 28, 2006

Abstract

AIM: To investigate the protective role of magnolol in the treatment of acute lung injury induced by acute necrotizing pancreatitis (ANP) in rats.

METHODS: Fifty-six Sprague-Dawley rats were divided into sham operation group, ANP group, and magnolol treatment group. ANP model was induced by retrograde infusion of 50 g/L sodium taurocholate into the biliopancreatic duct of rats. The mRNA expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and interleukin-10 (IL-10) in lung tissue were assayed using fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) at 6, 12, and 24 h. Meanwhile, the activity of serum amylase (Amy) was also determined, and the pathological changes of the pancreas and lung were observed.

RESULTS: In comparison with those in sham operation group, the expression of NF-κB, TNF-α, and IL-10 mRNA and the activity of serum Amy in ANP group were increased significantly (P < 0.01), and the expression of NF-κB, TNF-α mRNA and the activity of Amy reached the peak at 12 h. The expression of IL-10 mRNA increased gradually at 6, 12, and 24 h (0.20 ± 0.05, 0.27 ± 0.07, 0.45 ± 0.20, respectively). Magnolol treatment resulted in lower expression of NF-κB, TNF-α mRNA and serum Amy levels (1.30 ± 0.14 vs 1.84 ± 0.56, 0.41 ± 0.19 vs 0.72 ± 0.36, both P < 0.05; 104576 ± 24886 nkat/L vs 188621 ± 23747 nkat/L, P < 0.01, respectively, at 12 h), but didn't alter the expression of IL-10 mRNA (P > 0.05) as compared with that in ANP group. Magnolol treatment relieved the pathological changes markedly in the lung tissues but not in the pancreatic tissues.

CONCLUSION: Magnolol can decrease the expression of the proinflammatory factors such as NF-κB and TNF-α and relieve the acute lung injury induced by acute necrotizing pancreatitis in rats.

Key Words: Chemokine; Acute necrotizing pancreatitis; Acute lung injury; Magnolol; Rats

0 引言

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种严重危及生命的全身性疾病, 常发生多器官衰竭(MOF), 病死率高达30%, 其中65%的SAP患者死于急性呼吸窘迫综合征(ARDS), 而ARDS是急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的终末结局, 因而备受重视. 但其预防和治疗缺少有效药物. 厚朴能降逆平喘、行气止痛, 具有抗炎、抗氧化、抗凝、肌肉松弛等作用[1-2], 主要有效成分厚朴酚(magnolol, Mag)是一种含有酚羟基的生物活性物质, 能保护大鼠出血性休克和脓毒血症所致的急性肺损伤[3], 但对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)所致的急性肺损伤有无作用尚无报道. 通过牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备的大鼠ANP模型, 研究肺组织中核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-10(IL-10)在ANP时ALI发生机制中的重要作用, 并探讨中药Mag对ANP时ALI的治疗作用及其可能的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

♂Sprague-Dawley大鼠56只, 体质量250-300 g, 购自成都中医药大学实验动物中心, 实验前在本院(四川省人民医院)动物中心标准饮食饲养2 wk. 牛磺胆酸钠(Sigma公司)用生理盐水配制成浓度为50 g/L的溶液. 厚朴酚(购自成都思科华生物技术有限公司)用二甲基亚砜配成20 g/L的溶液, 再用生理盐水稀释成2 g/L的溶液. Trizol Reagent Supperscript Ⅱ逆转录试剂盒、DnaseⅠ均购自美国Invitrogen公司, PCR试剂购自MBI公司, 引物及Taqman荧光探针由上海生物公司合成, 其他试剂均为进口或国产分析纯. 奥林巴斯AU 2700全自动生化分析仪, 加拿大枫岭公司FTC 2000荧光定量PCR仪.

1.2 方法

大鼠实验前禁食12 h, 自由饮水. 20 g/L戊巴比妥钠溶液ip麻醉(剂量1 mL/kg体质量). 将其固定于手术板上, 腹部备皮后常规消毒、铺巾, 沿腹白线切开腹腔, 切口长约2-3 cm, 用小动脉夹阻闭胆胰管近肝门端, 寻找到胆胰管十二指肠开口处, 将4号钝性针头于胆胰管十二指肠开口对侧十二指肠壁处进针, 入肠腔后沿十二指肠壁滑行进入十二指肠乳头, 逆行穿刺入胆胰管约1 cm, 以小动脉夹固定针头, 并以四号丝线结扎针头处胆胰管防胆胰液外漏, 以0.1 mL/min匀速向胆胰管内推注50 g/L牛磺胆酸钠, 剂量为1.0 mL/kg, 注射完毕后3-5 min见胰腺组织出血、坏死, 松开动脉夹及结扎丝线, 退出针头, 缝合十二指肠进针处, 逐层缝合关闭腹腔. 以上操作均严格遵循无菌技术原则, 术后自由饮水, 禁食. 假手术组向胆胰管内推注生理盐水, 余操作同上. 取肺和胰腺组织, 液氮保存和100 g/L中性甲醛固定. 抽取腹主动脉血, 分离血清后保存. 大鼠随机分为假手术组(sham operation, SO, n = 8), 模型组(ANP, n = 24)和治疗组(Mag, n = 24). 治疗组于造模注射完50 g/L牛磺胆酸钠5 min后, 于阴茎背静脉注射2 g/L厚朴酚2 mg/kg, 分6, 12, 24 h时点处死大鼠. 检测血清淀粉酶用酶偶联法于全自动生化分析仪上测定结果. 组织固定后常规脱水、包埋、切片、HE染色, 由专一病理医师读片. 肺组织总RNA的抽提, 按Trizol液的说明书进行. RT-PCR反应体系均为20 mL, 70 ℃预处理5 min后冰上冷却, 按20 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 70 ℃ 10 min行RT反应. 取cDNA 5 mL行荧光定量PCR反应, GAPDH作为内参照校正定量, 以比较阈值法计算其基因的表达水平(表1).

表1 PCR目的基因的引物.

引物(产物大小)	上游、下游、探针	反应条件
IL-10(128 bp)	5'-GACGCTGTCATCGATTTCT-3'	94 ℃变性2 min; 按94 ℃ 20 s, 53 ℃ 30 s, 60 ℃ 40 s, 45个循环
	5'-GTTGATGAAGATGTCAAACTCA-3'
	5'-FAM-CATTCTTCACCTGCTCCAC-TAMRA-3'
NF-κB(96 bp)	5'-TCTGGCGCAGAAGTTAGGT-3'	94 ℃变性2 min; 按94 ℃ 20 s, 53 ℃ 30 s, 60 ℃ 40 s, 45个循环
	5'-CCAGAGACCTCATAGTTGT-3'
	5'-FAM-GGACTCAGCCGGAAGGCATT-TAMRA-3'
TNF-α(141 bp)	5'-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3'	94 ℃变性2 min; 按94 ℃ 20 s, 53 ℃ 30 s, 60 ℃ 40 s, 45个循环
	5'-CTGGGAGTAGATAAGGTACA-3'
	5'-FAM-CCAACGCCCTCCTGGCCAAT-TAMRA-3'
GAPDH(141 bp)	5'-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3'	94 ℃变性2 min; 按94 ℃ 20 s, 56 ℃ 30 s, 60 ℃ 40 s, 45个循环
	5'-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3'
	5'-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3'

统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行分析, 实验数据均用mean±SD表示, 两组间均数比较用单因素方差分析, 两变量间关系用直线相关分析.

2 结果

2.1 血清淀粉酶

与SO组相比, Mag和ANP各组血清Amy较假手术组显著升高, 以12 h血清淀粉酶升高最明显(P<0.01), Mag各治疗组血清淀粉酶均低于ANP各组, 以6, 12 h治疗组降低最明显(P<0.01, 表2).

表2 大鼠NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-10 mRNA的表达和血清淀粉酶水平 (n = 8, mean±SD).

分组	IL-10	NF-κB	TNF-α	淀粉酶(nkaf/L)
SO	0.15±0.09	0.77±0.19	0.18±0.07	35760±1399
ANP 6 h	0.20±0.05	1.26±0.19b	0.45±0.18b	140989±16758b
ANP 12 h	0.27±0.07b	1.84±0.56b	0.72±0.36b	188621±23747b
ANP 24 h	0.45±0.20b	1.42±0.31b	0.49±0.15b	138408±16455b
MAG 6 h	0.18±0.04	1.18±0.15b	0.31±0.15a	117851±9479bd
MAG 12 h	0.21±0.05	1.30±0.14ac	0.41±0.19ac	104576±24886bd
MAG 24 h	0.34±0.22a	1.24±0.16b	0.31±0.15ac	120494±35837b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs SO;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs ANP.

2.2 胰腺组织病理学

SO组胰腺外观正常; 诱发ANP后胰腺质地变硬, 呈黄色、灰褐色或紫黑色, 大网膜、肠系膜上见大量皂化斑, 腹腔有血性腹水. 显微镜下, SO组胰腺组织基本正常; 诱发ANP后大鼠胰腺有局灶性或大片坏死, 腺泡小叶结构破坏, 局部或大片出血, 伴有大量中性白细胞和单核细胞浸润. Mag各组胰腺组织外观及病理学改变与ANP各组无明显差异.

2.3 肺组织病理学

SO组肺外观正常; ANP 6 h后肺轻度水肿; 12和24 h肺水肿明显伴有出血. Mag组6 h时无明显水肿; 12和24 h时肺组织轻度水肿, 无出血或仅少许出血. 显微镜下, SO组肺组织基本正常(图1A); 诱发ANP 6 h后大鼠肺轻度充血、间质水肿, 少量中性粒细胞浸润; 12及24 h肺组织光镜下表现为中度以上肺间质水肿, 肺泡壁增厚, 大量中性粒细胞浸润, 部分肺间隔断裂, 代偿性肺气肿, 毛细血管扩张、充血, 可见灶性或片状出血, 肺泡上皮细胞和黏膜上皮细胞肿胀、空泡变性、坏死, 部分肺泡壁破裂, 融合成肺大泡, 支气管腔内有炎性栓子形成(图1B). Mag治疗组各时点肺病理学改变较ANP组明显减轻(图1C).

图1 ANP大鼠肺组织病理学(HE×200). A: SO组; B: ANP组肺泡壁增厚, 大量炎性细胞浸润; C: Mag组肺泡壁及炎性细胞浸润明显改善.

2.4 肺组织中炎性因子的表达(表2)

SO组肺组织中IL-10 mRNA, NF-κB mRNA, TNF-α mRNA表达量少, ANP各组NF-κB mRNA和TNF-α mRNA, IL-10 mRNA表达量均显著增高; 其中NF-κB mRNA和TNF-α mRNA表达量在12 h时达高峰, 24 h时下降, IL-10 mRNA随时间延长呈逐渐升高; Mag各组NF-κB mRNA, TNF-α mRNA表达量降低, 在12 h时有显著性差异(分别为1.30±0.14 vs 1.84±0.56, 0.41±0.19 vs 0.72±0.36, P<0.05, 图2A, B), 但IL-10 mRNA的改变无统计学意义.

图2 12 h点肺组织NF-κB mRNA和TNF-α mRNA的表达.

3 讨论

炎症因子在ANP的发病中起着关键性作用, 主要的炎症因子有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等. 其上游最重要的调控因子为NF-κB. NF-κB的激活是急性胰腺炎的早期事件, 过度表达可导致多种炎症因子基因的过度表达. 近年来, NF-κB已成为治疗急性胰腺炎新的靶点[4]. TNF-α主要产生于被激活的巨噬细胞, 是急性胰腺炎发病后较早产生的炎性细胞因子, TNF-α可激活中性粒细胞, 促进多种炎症介质的释放, 在ASP发病及其全身并发症如ARDS中起着重要作用, 其升高的程度与胰腺炎症损伤程度直接相关联. 白介素-10(IL-10)为一重要的抗炎因子, 能抑制促炎症因子的产生和对抗炎症因子的损伤. 肺组织中TNF-α和IL-10比值的升高能增加ARDS的危险[3]. 因此, 寻找能下调NF-κB表达、降低TNF-α和IL-10比值的天然植物成分可望治疗SAP及预防其并发症.

厚朴是清胰汤和大承气汤的重要组成部分, 被广泛用于急性胰腺炎的治疗并取得了较好的疗效. 祖国医学中厚朴具有降逆平喘、温中止痛、行气除满等功效, 现代医学证明, Mag具有抗炎、抗氧化、抗凝、肌肉松弛等作用, 能抑制中性白细胞释放炎性因子和递质[1,3,5-10], 抑制血小板的聚集[1-2], 阻止Ca²⁺内流, 从而松弛支气管平滑肌[11-12], 能保护大鼠出血性休克和脓毒血症所致的急性肺损伤[3], 抑制TNF-α的表达, 降低TNF-α和IL-10比值, 提高大鼠对内毒素血症的耐受性, 提高其生存率[3,5], 但其对急性坏死性胰腺炎所致的急性肺损伤及NF-κB等炎症因子有无作用则无相关报道. 本文的观察表明, Mag能抑制NF-κB mRNA、TNF-α mRNA在ANP大鼠肺组织中的表达, 对ANP合并急性肺损伤有一定的治疗作用. 本研究显示, 与假手术(SO)组相比, ANP组肺组织NF-κB mRNA, TNF-α mRNA, IL-10 mRNA及血Amy表达量均明显增加, 其中IL-10 mRNA随ANP时间的进展表达逐渐增加, 而后三项指标NF-κB mRNA, TNF-α mRNA及Amy的升高则以12 h最明显(P<0.01). 与ANP各组比较, Mag各组NF-κB mRNA, TNF-α mRNA表达显著下降(P<0.05), 血清Amy表达量下降(P<0.01), 也以12 h下降最显著; 但Mag组IL-10 mRNA的升高与ANP组相比差异无显著性(P>0.05). 肺组织病理学改变较模型组明显减轻. 由此可见, 厚朴酚能降低ANP时肺组织炎症因子的表达, 并减轻炎症细胞浸润, 改善其组织学反应. 肺组织学及炎症因子表达的改善以12 h为显著, 可能与厚朴酚的代谢有关, 增加给药次数能否使上述指标得到进一步好转尚需研究.

评论

背景资料

近年来, 尽管在急性胰腺炎(ANP)发病机制和治疗方面取得了一些进展, 但其预后并无根本性改变, 尤其对发生MODS者更缺少有效的治疗手段. ANP的发病机制与胰腺的自身消化、炎症因子的级联效应和内毒素的第二次打击具有密切关系, 其中炎症因子在ANP的发生和发展中起着决定性作用, 其上游最重要的调控因子为核因子-κB(NF-κB). NF-κB是一个广泛存在于细胞中具有多向性转录调节作用的蛋白因子, 能与多种细胞因子、黏附分子基因启动子部位的kB位点结合, 导致TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1等基因的过度表达, 因此近年来, NF-κB已成为急性胰腺炎治疗研究的新靶点, 正引起人们越来越浓厚的兴趣.

相关报道

厚朴能降逆平喘、行气止痛, 具有抗炎、抗氧化、抗凝、肌肉松弛等作用, 主要有效成分厚朴酚(magnolol, Mag)是一种含有酚羟基的生物活性物质, 能保护大鼠出血性休克和脓毒血症所致的急性肺损伤, 但对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)所致的急性肺损伤有无作用则尚无报道.

创新盘点

本文的初步结果证实, 厚朴酚对急性坏死性胰腺炎所致的急性肺损伤有一定的保护作用.

应用要点

厚朴酚可能用于预防急性急性坏死性胰腺炎所致的肺损伤.

同行评价

厚朴是清胰汤的重要组成部分, 而清胰汤已被证实对急性胰腺炎及其肺损伤, 特别是对炎症介质表达的调节具有重要作用, 因此本文有一定科学意义和临床指导价值.

备注

编辑:潘伯荣 电编:张敏

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