修回日期: 2005-04-01
接受日期: 2005-04-08
在线出版日期: 2005-05-01
目的: 建立不同红细胞免疫功能状态下的大肠癌肝转移小鼠模型, 并比较各模型组及对照组间红细胞免疫黏附功能(RBC immune adherence function, RIF).
方法: 将48只BALB/C小鼠分为4组: (1)正常对照组; (2)红细胞免疫正常小鼠结肠癌细胞脾移植肝转移组; (3)红细胞免疫缺陷组; (4)红细胞免疫缺陷并结肠癌细胞脾移植肝转移组. 观察各组小鼠红细胞C3b受体花环率(R-C3bR)、红细胞免疫复合物花环率(R-ICR)、红细胞免疫黏附肿瘤细胞花环率(RITCR)的表达情况.
结果: 各组R-C3bR、RITCR与组1(分别为18.50±3.82, 17.0±3.93, P<0.01)比较有显著性差异; 各组R-C3bR、R-ICR与组2(分别为13.80±2.44, 9.20±3.71, P<0.01)比较有显著性差异; 组3与组4比较, 各项指标比较无显著性差异(P>0.05).
结论: 给予低硒饲料喂养和接种肿瘤细胞均可造成小鼠RIF明显低下, 以前者作用更甚; 在低硒饲养已引起小鼠RIF低下的基础上, 再接种肿瘤细胞并不能使其RIF的减退继续加重. 各组模型方法稳定可靠, 重复性好, 能满足相关研究的需要.
引文著录: 王程, 杨运高. 不同红细胞免疫功能状态下的大肠癌肝转移小鼠模型的建立. 世界华人消化杂志 2005; 13(9): 1145-1147
Revised: April 1, 2005
Accepted: April 8, 2005
Published online: May 1, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(9): 1145-1147
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i9/1145.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i9.1145
肝脏接受门静脉和肝动脉双重血供, 是恶性肿瘤最常见的转移器官[1-3], 尤以大肠癌转移多见. 郭峰et al[4]的研究表明, 红细胞免疫黏附肿瘤细胞的作用在防止癌细胞血行运转中起着重要的作用, 其主要原理是癌细胞进入血循环后可旁路激活和黏附C3b而被红细胞CR1免疫黏附. 缺硒是造成红细胞免疫功能低下的重要原因[5], 而荷瘤小鼠亦会出现继发性的红细胞免疫功能障碍[6]. 不同红细胞免疫功能状态下的大肠癌肝转移小鼠模型的建立, 有利于进一步研究红细胞免疫与肿瘤转移的关系.
BALB/C小鼠纯系健康小鼠48只, 清洁级, 已断奶1 wk, 雌雄不拘, 小鼠及常规饲料由南方医科大学实验动物中心提供. 低硒饲料: 玉米粉67.0%、小麦粉27.5%、黄豆粉7.5%(以上饲料购自克山病病区), 酵母0.4%、食盐0.6%、鱼肝油2 μL/kg, 饲料含硒量为0.02 mg/kg由广东省畜禽饲料研究实验室用经典方法2, 3-二氨基萘荧光法测定.
1.2.1 模型复制及分组: BALB/C小鼠48只分为4组, 每组12只: (1)正常对照组; (2)红细胞免疫正常小鼠结肠癌细胞脾移植肝转移组; (3)红细胞免疫缺陷组; (4)红细胞免疫缺陷并结肠癌细胞脾移植肝转移组. 红细胞免疫缺陷模型建立方法: 已断奶1 wk BALB/C小鼠, 以低硒饲料连续饲养10 wk[5]. 小鼠结肠癌CT26细胞脾移植肝转移模型, 参考文献[7]方法. 动物经腹腔注射10%(体积比)的水合氯醛0.1 mL左右(0.1 mL/20 kg)麻醉成功后, 固定小鼠呈俯卧位, 于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间, 取5 mm切口进腹, 显露脾脏, 并拉出切口外, 用4号针头于脾脏下极进针, 边退边缓慢注入CT26细胞(由上海第二军医大学免疫教研室于益芝教授馈赠)悬液0.1 mL, 细胞含量为1×109/L, 可见注射部位的脾脏被膜变白及肿胀, 拔出针头, 夹住针眼处片刻. 查看无出血, 将脾脏放回原位, 全层缝合腹壁, 包扎. 红细胞免疫缺陷并结肠癌细胞脾移植肝转移模型, 已断奶1 wk BALB/C小鼠, 以低硒饲料连续饲养10 wk后按以上方法接种肿瘤细胞.
1.2.2 红细胞免疫功能的测定: 荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后15 d处死, 取血液测各项指标: 红细胞C3b受体花环率(RBC C3b receptor rosette, R-C3bR)、红细胞免疫复合物花环率(RBC immune complex receptor rosette, R-ICR)、红细胞免疫黏附肿瘤细胞花环率(RBC immune adherence tumor cell receptor rosette, RITCR), 测定方法参照文献[4], 以连接有2个以上酵母菌的红细胞为花环形成阳性, 计算红细胞花环率(%). 酵母多糖试剂、癌细胞试剂由第二军医大学长海医院血液免疫研究室提供.
统计学处理 采用SPSS10.0统计软件对结果进行独立样本t检验(independent-samples t test), 各组数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示, 组间均数比较用单向方差分析(One-way ANOVA), P<0.01为有统计学意义. 并对实验结束前仍存活的43只小鼠的R-C3bR、R-ICR、RITCR这3项指标进行偏相关分析.
解剖观察正常对照组、红细胞免疫缺陷组的小鼠肝脏颜色鲜红、有光泽, 表面光滑, 质地柔软, 体积均一.2个荷瘤模型组小鼠肝脏色泽晦暗, 各叶表面及切面均有白色转移瘤结节, 呈多发性弥散分布, 其大小不一, 转移率为100%; 各组脾脏有大小相对均一的肿瘤结节形成, 直径为0.4-0.9 cm的灰白色结节, 其他脏器未见转移灶. 剖腹后可见腹腔内均有血性腹水, 量不等; 肝脏转移瘤数目有个体差异, 部分小鼠肝脏明显肿大, 转移结节融合成块, 难以计数, 肝组织严重受破坏, 部分组织被转移结节替代, 与脾脏上肿瘤结节的形态结构相似. 光镜下观察, 荷瘤肝组织见癌细胞聚积成团, 伴有癌结节形成, 符合低分化腺癌的结构特征.
相关性研究将实验结束前仍存活的43只小鼠的R-C3bR、R-ICR、RITCR这3项指标进行偏相关分析, 结果显示R-C3bR与R-ICR呈显著性负相关(r = -0.6 223, P = 0.000), R-C3bR与RITCR呈显著性正相关(r = 0.6 327, P = 0.000), R-ICR与RITCR无明显相关关系.
各组R-C3bR、RITCR与组1比较有显著性差异(P<0.01), 各组R-C3bR、R-ICR与组2比较均有显著性差异(P<0.01); 组3与组4间比较, 各项指标无显著性差异(P>0.05, 表1).
肿瘤转移是一个连续过程, 癌细胞由运动因子启动, 离开原发部位进入血管, 重新黏附并穿出血管, 在局部形成细胞克隆, 继而血管增生, 形成转移灶[8]. 我们复制的红细胞免疫缺陷小鼠、红细胞免疫正常及缺陷状况下分别合并结肠癌细胞脾移植肝转移小鼠3种动物模型, 并比较各组模型间小鼠红细胞免疫功能. 针对大肠癌肝转移率高的特点, 我们选用的结肠癌CT-26细胞脾移植肝转移小鼠模型, 本法保留脾脏, 保存了宿主固有的抗肿瘤免疫功能, 较好地模拟了大肠癌根治术后因血行转移而发生肝脏转移的过程. 另外, 本法操作简便安全, 潜伏期短, 具有可重复的高转移发生率, 具有与患者类似的转移途径, 转移细胞保留了原细胞系的生物学特征.
红细胞CR1是一种膜糖蛋白, 红细胞C3b/C4b受体, 具有清除循环免疫复合物[9-10]、免疫黏附癌细胞并进一步攻击癌细胞的重要的生物学功能. 各模型组小鼠红细胞免疫功能发生紊乱, R-C3bR、R-ICR降低, RITCR升高. 以上3个指标并不保持绝对均衡, 可能与肿瘤侵袭过程中, 各指标变化不一样有关[11]. 实验结束前组3、组4的2组荷瘤小鼠分别有2只和3只小鼠死亡, 其余未接种肿瘤细胞的2组小鼠无1只死亡. 红细胞CR1占循环中总CR1的95%以上, 所以红细胞CR1分子在抗肿瘤转移方面起着不可忽视的作用, 并在一定程度上代表着红细胞免疫功能; 其清除免疫复合物的作用比白细胞大500-1000倍[12].
硒是构成谷胱甘肽过氧化物和烟酸羟化酶等重要的必需成分, 缺硒是造成红细胞免疫功能低下的重要原因. 我们发现, 低硒饲料饲养组较正常饲料饲养组小鼠RIF明显低下(表1). 在正常情况下, 机体免疫功能需要硒的参与和激活, 含硒酶谷胱甘肽过氧化物活性升高使红细胞抗氧化能力增强, 从而保护细胞膜的完整性. 长期给予动物低硒饲料, 低硒状态会影响有关酶的合成与活性, 加剧机体的过氧化反应, 使红细胞及其细胞膜结构和功能损伤[6], 使红细胞免疫黏附功能下降. 本研究的组3与组4间各项指标比较P>0.05, 表明在低硒饲养已引起小鼠RIF低下的基础上, 再接种肿瘤细胞并不能使其RIF的减退继续加重. 可见在肿瘤发生前或肿瘤早期及时纠正由其他原因引起的红细胞免疫低下是非常必要的. 模型组与正常对照组比较, 小鼠RIF降低, 差异有显著性(P<0.01), 表明缺硒和接种肿瘤细胞均可造成小鼠RIF继发性下降. 但其机制不同, 肿瘤移植后宿主红细胞免疫功能是随着肿瘤的生长和发展呈进行性降低, 在肿瘤侵袭时开始改变, 尤其在血道转移时期下降更为显著[6]. 荷瘤情况下多伴有继发性免疫抑制[13], 肿瘤免疫抑制因子的增多, 抑制了红细胞的免疫功能. 宿主红细胞CR1活性降低导致红细胞对肿瘤细胞的促吞噬作用减弱; 随着肿瘤的发展, 红细胞表面受体和凝聚性增高, 血中补体合成增多和补体系统活化增强, 黏附在红细胞膜表面的免疫复合物增多, 使R-ICR增高, CR1空位被免疫复合物占据, 由于红细胞清除肿瘤免疫复合物功能障碍, 补体与红细胞表面受体结合的不易脱位而导致占位性抑制, 从而使R-C3bR降低. 如此反复恶性循环, 造成肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击得以转移和扩散. 这种变化过程与肿瘤转移密切相关. 我们利用了该2种诱因分别建立了单独或叠加作用复制了不同红细胞免疫功能状态下的大肠癌肝转移小鼠模型, 各组模型方法稳定可靠, 重复性好, 能满足红细胞免疫及其与肿瘤转移等相关研究的需要.
红细胞免疫与肿瘤转移的关系仍然是一项探索性的工作, 许多亟待解决的问题摆在我们面前, 如红细胞免疫系统是如何参与抑制肿瘤转移的控制网络, 红细胞免疫抑制肿瘤转移功能与机体其他免疫功能的关系, 药物调控红细胞免疫功能而达到预防或减少肿瘤转移, 都有待进一步探讨.
编辑: 张海宁
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