研究快报 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2005. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2005-05-01; 13(9): 1142-1144
在线出版日期: 2005-05-01. doi: 10.11569/wcjd.v13.i9.1142
三氧化二砷对肝癌诱导血管内皮细胞相关基因蛋白表达的影响
崔永安, 秦叔逵, 陈惠英, 王锦鸿, 左小东
崔永安, 左小东, 扬州大学临床医学院肿瘤诊疗中心 江苏省扬州市 225001
秦叔逵, 陈惠英, 南京八一医院全军肿瘤中心 江苏省南京市 210002
王锦鸿, 南京中医药大学文献研究所 江苏省南京市 210029
基金项目: 全军"十·五"攻关课题No. MB2001; 江苏省科技厅资助项目, No. BQ98048; 南京军区重点课题, No. NJ9804.
通讯作者: 秦叔逵, 210002, 江苏省南京市杨公井34标34号, 南京八一医院全军肿瘤中心. qinsk@csco.org.cn
电话: 025-84453932
收稿日期: 2005-02-14
修回日期: 2005-03-01
接受日期: 2005-03-22
在线出版日期: 2005-05-01

目的: 研究三氧化二砷(As2O3)注射液对肝癌诱导血管内皮细胞相关基因蛋白表达的影响.

方法: 构建了人肝癌SMMC-7721细胞株诱导人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的实验模型, 应用免疫组织化学方法, 严密观察了As2O3注射液对SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞, 有关基因蛋白表达的影响.

结果: 2 mg/L的As2O3注射液, 对SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞表达肿瘤相关基因蛋白, 均有一定的调节作用; 可下调VEGF、整合素β1和EGFR的表达; 上调E-钙粘连蛋白的表达.

结论: As2O3注射液抗原发性肝癌及防治肝癌复发和转移的作用机制, 可能与其能调节肝癌细胞及血管内皮细胞VEGF、整合素β1、E-钙粘连蛋白和EGFR等基因蛋白的表达, 干预细胞的信号转导, 抑制肿瘤血管形成有关.

关键词: 无
引文著录: 崔永安, 秦叔逵, 陈惠英, 王锦鸿, 左小东. 三氧化二砷对肝癌诱导血管内皮细胞相关基因蛋白表达的影响. 世界华人消化杂志 2005; 13(9): 1142-1144
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: February 14, 2005
Revised: March 1, 2005
Accepted: March 22, 2005
Published online: May 1, 2005

N/A

Key Words: N/A
0 引言

正常细胞转化成为恶性肿瘤细胞的过程复杂而漫长, 从分子生物学角度来看, 这是细胞分子生物学调控机制从量变到质变, 长期积累的后果. 原癌基因的激活, 癌基因的异常表达, 抗癌基因和肿瘤转移相关基因的激活与表达, 都与肿瘤的形成、转移及耐药性关系至为密切. 肿瘤相关基因的研究, 在肿瘤形成机制和探讨抗肿瘤新的治疗方法中均有十分重要的意义. 我们主要探讨了As2O3注射液对人肝癌SMMC-7721细胞、血管内皮细胞ECV304及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞血管内皮生长因子(VEGF)、整合素β1(CD29)、E-钙粘连蛋白(E-CD)、表皮生长因子受体(EGFR)等有关基因蛋白表达的影响, 以期从细胞分子生物学角度进一步揭示As2O3抗肿瘤的作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

人类肝癌细胞株SMMC-7221和建株人脐静脉内皮细胞(ECV304), 均引自中国科学院上海细胞生物研究所. 亚砷酸注射液(As2O3注射液), 哈尔滨伊达药业有限公司产品, 批号为20010703, 规格10 mL: 10 mg. 使用前用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养[1]: SMMC-7721细胞和ECV304细胞接种于无菌培养瓶中, 加入适量RPMI-1640培养液, 于37℃、50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中培养. 每3-5 d传代1次. 肝癌细胞条件培养液培养ECV304细胞, 则用预先制备的肝癌细胞条件培养液, 代替普通RPMI-1640培养液, 进行细胞培养. 肝癌细胞条件培养液的制备[2]: 取SMMC-7721细胞, 按2×108/L/孔接种于6孔板, 48 h后, 收集条件培养液, 滤膜过滤后备用.

1.2.2 免疫组化检测: 按免疫组化超敏试剂盒(SP)说明书的步骤, 参照方福德et al[3]介绍的方法操作. 分别收集与As2O3(终浓度为2 mg/L)共孵育48 h的SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞, 涂片, 风干, 4℃纯丙酮固定, 晾干. 每张涂片加50 μL过氧化酶溶液以阻断内源性过氧化酶的活性, 室温下孵育10 min, PBS(pH7.4)冲洗3次, 每次5 min; 每张涂片加50 μL的非免疫性动物血清, 室温下孵育10 min; 吸去多余的液体, 每张涂片加50 μL的一抗(VEGF、整合素β1、E-钙粘连蛋白及EGFR), 室温下孵育1 h, PBS冲洗3次, 每次5 min; 每张涂片加50 μL生物素标记的二抗, 室温下孵育10 min, PBS冲洗3次, 每次5 min; 每张涂片加50 μL链酶菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液, 室温下孵育10 min, PBS冲洗3次, 每次5 min; 每张涂片加100 μL新鲜配制的DAB溶液, 显微镜下观察3-10 min, 自来水冲洗, 苏木素复染, PBS冲洗返蓝, 中性树胶封固, 镜检. 采用已知阳性切片作阳性对照, 用PBS代替一抗作阴性对照.

1.2.3 免疫组化染色阳性判断: 以胞质和/或胞膜呈棕黄色为阳性细胞, 油镜下观察200个细胞, 计算阳性细胞百分率. 阳性率<5%为(-); 5%-25%为(+); 26%-50%为(2+); >50%为(3+).

统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行t检验和Spearman秩相关检验统计分析.

2 结果
2.1 As2O3对ECV304细胞相关基因蛋白表达的影响(表1)
表1 三氧化二砷对ECV304细胞肿瘤相关基因表达的影响(mean±SD, n = 6).
VEGFEGFRCD-29E-CD
对照组123.17±23.67126.67±16.82102.67±25.9013.33±5.501
用药组9.5±5.49.5±5.899±6.19103±18.58
ｔ11.46616.108.61411.335
P<0.01<0.01<0.01<0.01

ECV304细胞未加药组, VEGF基因表达强(3+), CD29基因表达强(3+), E-CD基因表达弱(+), EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到明显抑制(-), CD29表达明显被抑制(-), E-CD表达增强(3+), EGFR表达明显抑制(-).

2.2 As2O3对SMMC-7721细胞相关基因蛋白表达的影响(表2)
表2 三氧化二砷对SMMC-7721细胞肿瘤相关基因表达的影响(mean±SD, n = 6).
VEGFEGFRCD-29E-CD
对照组75.83±27.61106±27.80108.67±33.7415±8.56
用药组10.83±6.1519.33±14.8314.5±8.85107.5±21.51
ｔ5.6296.7386.6139.788
P<0.01<0.01<0.01<0.01

SMMC-7721细胞未加药组, VEGF基因表达较强(2+), CD29基因表达强(3+), E-CD基因表达弱(+), EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到抑制(+), CD29表达明显被抑制(+), E-CD表达明显增强(3+), EGFR表达明显抑制(+).

2.3 As2O3对肝癌细胞条件液培养的ECV304细胞相关基因 蛋白表达的影响(表3)
表3 三氧化二砷对肝癌细胞条件液培养的ECV304细胞肿瘤相关基因表达的影响(mean±SD, n = 6).
VEGFEGFRCD-29E-CD
对照组131.67±25.16142.83±15.1399.83±21.7817.33±9.87
用药组21.83±7.639.33±4.189.67±5.8998.67±18.86
ｔ10.23320.8319.7879.357
P<0.01<0.01<0.01<0.01

SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞未加药组, VEGF基因表达强(3+), CD29基因表达强(2+), E-CD基因表达弱(+), EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到抑制(+), CD29表达明显抑制(-), E-CD表达增强(2+), EGFR表达明显抑制(-).

3 讨论

从肿瘤相关基因着手来系统地研究肿瘤的形成、转移和复发过程, 是目前国内、外肿瘤学研究的热点课题. 肿瘤相关基因的种类多种多样, 按其功能可分为生长因子、生长因子受体、具有催化活性的信号转导蛋白、不具备催化活性的信号转导蛋白、核转录因子等. 因此, 肿瘤相关基因的生物学功能也是多种多样的. 对肿瘤相关基因的研究, 有助于了解肿瘤形成的过程. 从肿瘤本身的细胞总数来看, 肿瘤细胞总数在生长阶段是不断增加的. 从细胞凋亡角度来看, 肿瘤细胞的细胞凋亡倾向降低. 无论是细胞生长过度, 还是细胞凋亡倾向降低, 其最终的结果是肿瘤本身的细胞总数增加, 肿瘤体积不断增大. 而无论是肿瘤的增殖还是凋亡, 从分子生物学角度来看, 都是由于基因的表达与调控, 即肿瘤相关基因的表达与调控所决定的. 因此, 肿瘤相关基因的研究, 对于了解肿瘤的增殖和凋亡过程, 探索肿瘤转移的机制, 研究新型的肿瘤标志物, 促进肿瘤特异性诊断技术的开发和应用, 以及开拓肿瘤的生物学治疗方法, 都有十分重要的意义.

以往的研究表明, As2O3可诱导人肝癌细胞凋亡, 对肿瘤相关基因具有调节作用. 如As2O3可上调肝癌细胞凋亡促进基因bax和Fas的表达[4-8], 下调凋亡抑制基因bcl-2的表达[9]. 对VEGF、MMP-2、CD44有下调作用, 对nm23有上调作用[10]. 我们的研究结果进一步表明.

3.1 As2O3具有抑制VEGF基因蛋白表达的作用

VEGF及其受体(VEGFR)在肝癌癌组织中较正常肝组织呈过高表达, 与肝癌的生长、转移、复发及治疗密切相关[11-12]. 我们的实验表明, As2O3作用于SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞后, ECV304细胞未加药组, VEGF基因表达强(3+), 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到明显抑制(-); SMMC-7721细胞未加药组, VEGF基因表达较强(2+), 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到抑制(+); SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞未加药组, VEGF基因表达强(3+), 经As2O3药物作用后, VEGF表达受到抑制(+). 说明As2O3注射液可通过下调VEGF的表达, 影响VEGF的信号通路, 来抑制肿瘤血管形成、控制肿瘤细胞的生长.

3.2 As2O3可抑制肝癌细胞及血管内皮细胞整合素β1(CD29)的表达

肝癌组织内CD29的表达明显高于非肝癌组织, 并且与肝癌的侵袭性和转移有关[13-15]. 我们的研究表明, ECV304细胞未加药组, CD29基因表达强(3+), 经As2O3药物作用后, CD29表达明显被抑制(-); SMMC-7721细胞未加药组, CD29基因表达强(3+), 经As2O3药物作用后, CD29表达明显被抑制(+); SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞未加药组, CD29基因表达强(2+), 经As2O3药物作用后, CD29表达被抑制(-). 说明As2O3注射液抗肝癌作用机制之一, 可能与下调整合素β1的表达有关, 通过影响整合素β1的信号通路, 影响整合素介导的肝癌细胞与肝癌细胞、肝癌细胞与细胞外基质的黏附, 影响整合素调控的细胞外基质的降解、肿瘤细胞的运动, 及肿瘤血管形成中的某个环节, 来控制肿瘤细胞的生长.

3.3 As2O3可上调肝癌细胞及血管内皮细胞E-钙粘蛋白(E-CD)的表达

E-CD在肝癌发生、发展过程中发挥重要作用, 肝癌组织中E-CD的表达与癌灶体积有显著的相关性, E-CD蛋白表达的降低是肝癌重要的恶性生物学指标, 对了解和判断肝癌的恶性程度及患者的预后具有重要意义[16-17]. 本研究表明, ECV304细胞未加药组, E-CD基因表达弱(+), 经As2O3药物作用后, E-CD表达明显增强(3+); SMMC-7721细胞未加药组, E-CD基因表达弱(+), 经As2O3药物作用后, E-CD表达明显增强(3+); SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞未加药组, E-CD基因表达弱(+), 经As2O3药物作用后, E-CD表达有所增强(2+). 说明As2O3注射液抗肝癌作用机制之一, 可能与提高E-CD蛋白表达有关, 通过影响E-CD的信号通路, 影响E-CD介导的肝癌细胞与肝癌细胞、肝癌细胞与细胞外基质的黏附, 影响E-CD调控的细胞外基质的降解、肿瘤细胞的运动, 及肿瘤血管形成中的某个环节有关.

3.4 As2O3对肝癌细胞EGFR表达具有抑制作用

EGFR在人肝癌的发生、发展中发挥一定的作用[18]. As2O3作用SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞后, ECV304细胞未加药组, EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, EGFR表达明显抑制(-); SMMC-7721细胞未加药组, EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, EGFR表达明显抑制(+); SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞未加药组, EGFR基因表达强(3+); 经As2O3药物作用后, EGFR表达明显抑制(-). 说明As2O3注射液可通过下调肝癌细胞EGFR蛋白的表达, 影响EGFR所介导的信号转导通路, 从而抑制了肿瘤细胞的增殖和迁移, 抑制了肿瘤新生血管形成, 达到治疗肿瘤、防治肿瘤转移和复发的目的.

由于EGFR及其配体与E-CD、整合素等因子表达具有相关性, 其中某一因子发生表达改变, 或相互作用共同改变, 均可对肿瘤的发生、发展及转移产生重要影响. 我们的研究结果表明, As2O3注射液对这些因子的表达均有一定调节作用, 但其间的相互关系如何, 尚有待进一步研究.

编辑: 张海宁

1.  鄂 征. 组织培养技术及其在医学研究中的应用. 第1版. 北京: 中国协和医科大学出版社 2004; 125.  [PubMed]  [DOI]
2.  王 兵, 王 杰军, 徐 钧, 许 青, 高 勇, 郭 静. 人参皂苷Rg3对胃癌诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用. 肿瘤防治杂志. 2001;8:234-236.  [PubMed]  [DOI]
3.  方 福德, 周 吕, 丁 濂, 张 德昌. 现代医学实验技巧全书(上、下册). 第1版. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1995; 165.  [PubMed]  [DOI]
4.  秦 叔逵, 陈 洪, 陈 惠英, 马 军, 潘 其声, 刘 文虎. 三氧化二砷诱导人肝癌细胞株凋亡的初步研究. 临床肿瘤学杂志. 1998;3:40.  [PubMed]  [DOI]
5.  刘 琳, 秦 叔逵, 王 锦鸿, 陈 惠英, 陈 洪, 马 军, 刘 文虎. 三氧化二砷对人肝癌细胞增殖和超微结构的影响. 肿瘤防治研究. 2001;28:426-428.  [PubMed]  [DOI]
6.  陈 洪, 秦 叔逵, 潘 麒声, 陈 惠英, 马 军. 三氧化二砷抗肝癌作用的实验研究. 中华肝脏病杂志. 2000;8:27-29.  [PubMed]  [DOI]
7.  刘 琳, 秦 叔逵, 陈 惠英, 陈 洪, 刘 文虎, 王 锦鸿. 三氧化二砷对人肝癌细胞选择性抑制作用的实验研究. 临床肿瘤学杂志. 1999;4:39-41.  [PubMed]  [DOI]
8.  陈 惠英, 刘 文虎, 秦 叔逵. 三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用. 世界华人消化杂志. 2000;8:532-535.  [PubMed]  [DOI]
9.  刘 琳, 秦 叔逵, 陈 惠英, 王 锦鸿, 陈 洪, 马 军, 刘 文虎. 三氧化二砷选择性诱导人肝癌细胞凋亡及相关基因的实验研究. 中华肝脏病杂志. 2000;8:367-369.  [PubMed]  [DOI]
10.  华 海清, 秦 叔逵, 王 锦鸿, 陈 惠英. 三氧化二砷抗肿瘤血管形成研究. 世界华人消化杂志. 2004;12:27-31.  [PubMed]  [DOI]
11.  Suzuki H, Seto K, Shinoda Y, Mori M, Ishimura Y, Suematsu M, Ishii H. Paracrine upregulation of VEGF receptor mRNA in endothelial cells by hypoxia-exposed hep G2 cells. Am J Physiol. 1999;276:G92-97.  [PubMed]  [DOI]
12.  邓 靖宇, 何 生. VEGF在肝癌中作用. 世界华人消化杂志. 2004;12:454-458.  [PubMed]  [DOI]
13.  郭 悦青, 易 继林, 闫 振宇, 熊 荣斌, 叶 关泉. 整合素Integrin b1在原发性肝癌组织内的表达及意义. 数理医药学杂志. 2004;17:312-315.  [PubMed]  [DOI]
14.  王 桂兰, 陈 莉. 整合素在肝癌研究中的意义. 临床肿瘤学杂志. 2004;9:325-340.  [PubMed]  [DOI]
15.  Yamamoto H, Itoh F, Adachi Y, Sakamoto H, Adachi M, Hinoda Y, Imai K. Relation of enhanced secretion of active matrix metalloproteinases with tumor spread in human hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 1997;112:1290-1296.  [PubMed]  [DOI]
16.  Matsumoto A, Ono M, Fujimoto Y, Gallo RL, Bernfield M, Kohgo Y. Reduced expression of syndecan-1 in human hepatocellular carcinoma with high metastatic potential. metastatic potential. Int J Cancer. 1997;74:482-491.  [PubMed]  [DOI]
17.  成 峰, 王 学浩, 钱 建民, 张 峰, 李 相成. E钙粘蛋白、syndecan-1蛋白在肝细胞性肝癌中的表达与肝癌侵袭的关系. 中华普通外科杂志. 2003;18:141-142.  [PubMed]  [DOI]
18.  Fukusato T, Mori S, Kawamoto T, Taniguchi S, Machinami R. Immunohistochemical and ultrastructural localization of epidermal growth factor receptor in human liver and hepatocellular carcinoma tissues. Acta Pathol Jpn. 1990;40:22-29.  [PubMed]  [DOI]