修回日期: 2005-03-04
接受日期: 2005-03-10
在线出版日期: 2005-05-01
目的: 观察结肠癌细胞对人单个核细胞源树突状细胞(DC)诱导的CTL杀伤效应的影响, 探讨其在人体的免疫逃避机制.
方法: 人外周血分离单个核细胞以GM-CSF和IL-4培养DC, 用结肠癌LS174细胞的提取物诱导DC, 并激活T淋巴细胞抗肿瘤效应, 在此不同过程中, 体系中加入人结肠癌细胞系LS174的培养上清液. 以正常培养体系为对照, 通过计算细胞毒杀伤率检测不同条件下DC激活同种异体T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力.
结果: LS174细胞培养上清液作为条件培养的DC, 在DC培养的早期阶段对DC激活过程有明显的影响(在DC培养的第1 d加入肿瘤培养上清组, 第3 d加入肿瘤培养上清组vs正常培养的DC组, DC培养第5 d加入肿瘤培养上清组, DC激活T淋巴细胞过程加入肿瘤培养上清组, P<0.05).
结论: 肿瘤细胞分泌的某些物质可在DC培养的早期阶段影响肿瘤的免疫, 这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一.
引文著录: 陈翔, 汪森明, 孙海, 何威. 结肠癌LS174细胞培养上清对树突状细胞诱导CTL杀伤效应的影响. 世界华人消化杂志 2005; 13(9): 1131-1133
Revised: March 4, 2005
Accepted: March 10, 2005
Published online: May 1, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(9): 1131-1133
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i9/1131.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i9.1131
随着对肿瘤免疫机制的了解以及对树突状细胞(dendritic cell, DC)独特功能的进一步了解, 肿瘤免疫治疗特别是以DC为主的肿瘤疫苗研究成为肿瘤治疗研究的重点之一. DC作为一种专职的抗原呈递细胞能摄取和加工抗原, 激发T细胞免疫, 是目前已知体内功能最强的抗原呈递细胞, 在肿瘤细胞免疫中起着十分重要的作用. 目前的研究表明, 多数肿瘤患者的DC功能受到不同途径、不同程度的抑制, 不能有效激发机体T细胞免疫[1]. 为探讨肿瘤免疫中DC激活免疫的机制, 我们观察了肿瘤细胞分泌物对负载抗原的DC激活T淋巴细胞, 并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应过程中的影响, 探讨肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制.
RPMI1640干粉, 胎牛血清, L-谷氨酰胺(L-glutamine), 青霉素-链霉素(P-S)双抗(Gibco公司); MTT试剂、二甲基亚砜(美国Sigma公司); Ficoll淋巴细胞分离液(相对密度1.077±1 g/L)(LymphoprepTM公司); 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(Peprotech公司); 结肠癌系LS174细胞(由南方医院消化内科馈赠).
1.2.1 结肠癌肿瘤细胞全细胞性抗原的制备: 常规培养并收集LS174肿瘤细胞, 用RPMI-1640培养基液稀释结肠癌细胞, 使其成为细胞浓度为5×109/L的细胞悬液, 分装于冻存管, 严密封口, 用液氮行快速冷冻, 10 min后迅速置入37℃水浴中, 待其完全融化后, 再次放入液氮中, 反复3次, 离心(1 000 r/min)并收集肿瘤细胞碎片作为肿瘤抗原提取物[2].
1.2.2 肿瘤细胞培养上清液的制备: 收集处于对数生长期的LS174细胞, 计数, 以2×104/cm2的密度种于50 mL培养瓶中, 37℃、50 mL/L CO2孵育箱中培养3 d后收集上清液, 过滤, 加入RPMI1640完全培养基, 于-70℃冻存备用[3].
1.2.3 外周血单个核细胞(PBMC)的分离: 用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC, 分离步骤简述如下: 在离心管内加入体积比为1: 2的淋巴细胞分离液和肝素化的新鲜稀释血液, 离心20 min(1 500 r/min), 吸取界面层单个核细胞, Hanks液洗涤2次(1 000 r/min, 10 min).
1.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离: 取其他健康人外周血, 经淋巴细胞分离液分离后获得单个核细胞, PBS洗去血小板后, 37℃贴壁2 h去除贴壁细胞, 非贴壁细胞以RPMI 1640悬浮, 注人T细胞尼龙毛柱, 37℃孵育1 h后, 冲洗出非黏附细胞做为同种异体T细胞.
1.2.5 DC体外培养: DC的诱导参照文献[4]方法, 并稍作修改. 用RPMI1640完全培养基(含100 mL/L灭活胎牛血清, 2 mmol/L L-谷氨酰胺, 0.05 mmol/L 2-巯基乙醇, 105 U/L P-S双抗), 将PBMC密度调到2×109/L, 加入24孔板, 每孔1 mL, 37℃、50 mL/L CO2培养2 h, 洗去非贴壁细胞. 贴壁细胞分两组培养. A组: 为正常组, 仅用含IL-4(100 μg/L)和GM-CSF(100 μg/L)的RPMI1640完全培养基培养; B组: 为肿瘤上清抑制组, 分为B1、B2、B3三组, 除加入IL-4(100 μg/L)和GM-CSF(100 μg/L)的RPMI1640完全培养基外, 分别于第1、3、5 d加入25%肿瘤培养上清液. 每3 d半量更换新培养基、rhGM-CSF、IL-4和肿瘤上清培养液, 共培养7 d, 培养结束前1 d加或不加肿瘤坏死因子TNF-α(100 μg/L).
1.2.6 致敏DC诱导的特异性CTL对LS174细胞杀伤效应的检测[5]: (1)致敏DC的获取: DC培养第4 d, 两组每孔分别加入终浓度为40 μg/L LS174肿瘤靶细胞冻融物, 第7 d收集悬浮DC, 即为负载冻融LS174肿瘤抗原的DC. (2)负载抗原的致敏DC诱导特异性CTL的产生: T淋巴细胞与负载特异性抗原DC按100: 1比例混合培养72 h, 即为CTL. 悬浮DC以1×104/孔加入24孔圆底培养板, 正常培养所获A组DC分3组(A1, A2, A3), 其中A2、B1组加入以25%肿瘤培养上清液悬浮的人同种T细胞1×106, 其余每孔加入RPMI1640完全培养液悬浮的人同种T细胞1×106, 混合培养72 h. (3)细胞毒性实验: 将DC、CTL离心后吸去上清, 其中A3, B1组以浓度为25%肿瘤培养上清液悬浮, 其余各组以RPMI1640完全培养液悬浮, 调节细胞浓度为1×106/mL, 每组分6复孔, 每孔加入100 μL细胞悬液, 按效应细胞: LS174为50: 1比例, 每组3孔, 每孔加入LS174靶细胞2×104, 每组另外3孔为效应细胞对照孔, 每孔的液体总量为200 μL, 置37℃、50 mL/L CO2的孵箱中孵育12 h, 加入5 mmol MTT 20 μL/孔, 培养4 h, 吸弃上清, 加入二甲基亚砜200 μL/孔, 水浴振荡 10 min, 静止 20 min. 在酶标仪上于570 nm处读出各实验组的光密度值(A值), 计算其细胞杀伤率. 细胞杀伤率计算公式如下: 细胞杀伤率(%) = (DC和CTL细胞孔A570+单纯靶细胞孔A570-细胞毒实验孔A570)/单纯靶细胞A570×100%
PBMC经2 h贴壁后, 贴壁细胞数量较少、体积小, 诱导2 d, 贴壁细胞伸展, 呈高度多形性; 培养6-7 d细胞形态不规则, 粗细不等的毛刺多而密, 呈现典型的DC形态. 含有肿瘤细胞培养上清液的DC, 第5 d时细胞团散开, 较多贴壁伸展的巨噬细胞, 典型的毛刺状细胞较少见.
采用SPSS10.0统计软件, 进行各组间One-WayANOVA分析. A1组无肿瘤上清抑制, A2组肿瘤上清抑制DC诱导T细胞为CTL, A3组肿瘤上清抑制CTL细胞毒作用, B1组第1 d肿瘤上清抑制DC成熟, B2组第3 d肿瘤上清抑制DC成熟, B3组第5 d肿瘤上清抑制DC成熟. 其中A1组与B1、B2组有明显的差异(P<0.05), A1组与A2组、A3组、B3组之间无明显差异(表1).
我们联合应用GM-CSF及IL-4直接从外周血中培养出大量DC. 结果显示, 源于外周血的PBMC在体外经GM-CSF及IL-4共同刺激, 再通过源于结肠癌LS174肿瘤细胞的肿瘤抗原粗提物刺激后能够诱导同种异体混合T淋巴细胞产生CTL, 具有高效的抗肿瘤免疫反应. 通过本组实验结果还可见到, 在DC激活T淋巴细胞的过程的早期阶段, 加入肿瘤培养上清可以具有一定的抑制CTL的特异免疫反应, 与对照组有显著差异. 在DC培养的第1 d和第3 d加入肿瘤培养上清对DC激活T淋巴细胞的抗肿瘤免疫作用有明显抑制作用. 而在DC培养的第5 d加入肿瘤培养上清则不能抑制抗肿瘤作用, 在DC提呈抗原给T淋巴细胞过程及激活的CTL杀伤靶细胞的过程中, 加入肿瘤培养上清同样不能抑制抗肿瘤作用.
肿瘤免疫耐受的机制可能有[6]: (1)肿瘤抗原的免疫原性弱; (2)肿瘤表面主要组织相容复合分子(MHC)、协同刺激因子及黏附因子的表达下降; (3)DC表面共刺激分子的表达缺失或下调; (4)肿瘤产生某些免疫抑制因子, 如血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)等, 对DC成熟和分化的抑制; (5)大多数肿瘤抗原属于自体抗原, 易于诱发免疫耐受; (6)肿瘤细胞抗凋亡或诱导免疫细胞凋亡. 实验中在DC培养的早期加入结肠腺癌LS174细胞培养液上清, 能有效抑制抗肿瘤免疫反应, 可能是结肠癌分泌的可溶性免疫抑制因子导致DC的不成熟或功能缺陷, 不能有效提呈抗原. 而在DC培养后期, 则不受肿瘤分泌因子的影响. 在DC尚处于未成熟阶段, 肿瘤分泌物可减少DC的增殖成熟, 还可能通过分泌IL-10等因子影响DC的有效提呈功能. 说明在DC提呈抗原激活T细胞的过程中, 肿瘤对此过程的细微影响就可能导致免疫耐受或不应答.
Schuler et al[7]总结了近年来运用抗原负载的DC瘤苗进行的实验及临床研究, 认为对DC瘤苗的研究不仅需要临床研究的标准一致化, 还要对DC生物特性的更为细致的研究. DC对T细胞的激活过程非常复杂, 至少需要两个信号的传导[8]. DC功能可受到体内微环境的影响而诱导对抗原免疫耐受的可能, 如用IL-10处理后, DC能提呈抗原诱导耐受. 多种肿瘤分泌IL-10, 通过肿瘤微环境中的DC诱导免疫耐受, 这可能是肿瘤逃避免疫攻击的机制之一. 但体外培养成熟的DC可以抵抗肿瘤IL-10的免疫抑制功能[9]. 从实验中也可见到, 在成熟DC诱导T细胞为CTL以及CTL对靶细胞杀伤的过程中, 加入肿瘤培养上清并不能抑制CTL的杀伤活性, 说明成熟后的DC及CTL较少受到肿瘤分泌的可溶性因子的影响, 可以诱发出有效的抗肿瘤免疫反应.
编辑: 张海宁
| 1. | Almand B, Resser JR, Lindman B, Nadaf S, Clark JI, Kwon ED, Carbone DP, Gabrilovich DI. Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer. Clin Cancer Res. 2000;6:1755-1766. [PubMed] |
| 2. | Nair SK, Snyder D, Rouse BT, Gilboa E. Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen-presenting cells pulsed with tumor extracts. Int J Cancer. 1997;70:706-715. [PubMed] |
| 3. | Gabrilovich DI, Chen HL, Girgis KR, Cunningham HT, Meny GM, Nadaf S, Kavanaugh D, Carbone DP. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med. 1996;2:1096-1103. [PubMed] |
| 4. | 朱 学军, 曹 雪涛, 于 益芝, 陈 国友, 万 涛, 马 施华, 唐 华, 章 卫平. 人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定. 中国肿瘤生物治疗杂志. 1997;4:302-306. |
| 6. | Ahmad M, Rees RC, Ali SA. Escape from immunotherapy: possible mechanisms that influence tumor regression/progression. Cancer Immunol Immunother. 2004;53:844854. [PubMed] |
| 7. | Schuler G, Schuler-Thurner B, Steinman RM. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2003;15:138147. [PubMed] |
| 8. | Espinoza-Delgado I. Cancer vaccines. Oncologist. 2002;7:20-33. [PubMed] |