病毒性肝炎肝组织TNF-α和NF-κBmRNA的表达与肝细胞凋亡

摘要

目的: 检测TNF-α, NF-κBmRNA在病毒性肝炎中的表达以及与肝细胞凋亡的关系.

方法: 采用免疫组织化学方法、原位杂交技术以及原位末端标记技术(TUNEL实验)检测65例病毒性肝炎患者和10例非肝病对照者肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA的表达和肝细胞凋亡的情况.

结果: 病毒性肝炎患者肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA阳性表达率分别为76.9%和70.3%, 明显高于对照组的20.0%和10.0%(P<0.01); TNF-α和NF-κBmRNA的表达与肝细胞凋亡密切相关(rs = 0.267和rs = 0.362, P<0.05); 病毒性肝炎患者肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA的表达存在明显的相关性(rs = 0.385, P<0.05). 随着慢性肝炎病理损伤的程度的加重, NF-κBmRNA的阳性表达率增高(P<0.05).

结论: TNF-α, NF-κBmRNA的表达在病毒性肝炎的发病及肝细胞凋亡的发生中存在相关性. TNF-α, NF-αBmRNA的表达随着病变程度的加重而增高.

关键词: 病毒性肝炎; TNF-α; NF-κBmRNA; 免疫组织化学方法; 原位杂交技术; 凋亡

Expression of TNF-α antigen and NF-κBmRNA in liver tissue and its effect on hepatocyte apoptosis

Shu-Fang Yuan, Xin Shan, Yue-Xin Zhang, Cun Liu

Shu-Fang Yuan, Xin Shan, Department of Gastroenterology, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medicai University, Xinjiang 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Yue-Xin Zhang, Hospital for Liver Disease, Xinjiang Medicai University, Xinjiang 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Cun Liu, Department of Pathology, Xinjiang Medicai University, Xinjiang 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Correspondence to: Shu-Fang Yuan, Department of Gastroenterology, the fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medicai University, Xinjiang 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China.

Received: February 14, 2005
Revised: March 1, 2005
Accepted: March 16, 2005
Published online: May 1, 2005

Abstract

AIM: To explore the expression of TNF-α antigen and NF-κBmRNA in liver tissues of hepatitis patients and its effect on hepatocyte apoptosis.

METHODS: Sixty-five paraffin setions from patients with viral hepatitis were studied, while ten cases of normal liver tissues were selected as control. Immunohistochemistry was employed to determined the expression of TNF-α antigen. NF-κBmRNA was measured by in situ hybridization. Apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidy1 transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).

RESULTS: The expression of TNF-α antigen and NF-κBmRNA in patients with viral hepatitis were 76.9% and 70.3% respectively, which were significantly increased as compared with those (20.0% and 10.0%) in control (P<0.01). The expression of TNF-α antigen, NF-κBmRNA were significantly correlated with the apoptosis of hepatocytes (r_s = 0.267 and r_s = 0.362, P<0.05). There was also a significant relationship between TNF-α antigen and NF-κBmRNA expression in liver tissue of hepatitis (r_s = 0.385, P<0.05). With the development of viral hepatitis, the expression of NF-κBmRNA was markedly increased (P<0.05).

CONCLUSION: TNF-α antigen and NF-κBmRNA are positively related to the occurrence, development of viral hepatitis as well as hepatocyte apoptosis.

Key Words: Viral hepatitis; TNF-α; NF-κBmRNA; Immunohistochemistry; In situ hybridization; Apoptosis

0 引言

病毒性肝炎是我国肝硬化最常见的病因, 主要为乙型、丙型或乙型加丁型重叠感染. 其中HBV感染, 不仅可引起急性、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关. 全世界大约有20亿人感染过HBV, 其中约4亿人为HBV携带者. 全球每年约有100万人死于HBV感染相关疾病, 占疾病死因的第9位[1-3]. 我国病毒性肝炎的发病居世界首位, 现有HBV患者3 000万. 由于肝炎病毒、细胞分子、凋亡相关基因、自身免疫等多种因素参与, 至今病毒性肝炎的治疗仍是当今世界面临的一个难题. 近年来研究证实肝纤维化可以逆转, 但目前尚缺乏高效、无明显副作用的药物. 目前的热点和难点是彻底弄清激活肝细胞变化的调控机制, 而凋亡作为一种可能的调控机制日益受到重视. 我们研究TNF-α, NF-κBmRNA在病毒性肝炎中的表达与肝组织炎症活动度、肝纤维化、肝细胞凋亡的情况, 来寻找一种抑制肝纤维化向肝硬变转变的新措施, 为临床肝病的诊断及治疗提供理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料

乙型肝炎58例, 丙型肝炎7例. 男34例, 女31例, 年龄13-59(平均34.1)岁. 汉族45例, 维族19例. 血清学证实HBsAg或抗-HCV阳性, 并采用免疫组化检测肝组织中病毒标志物. 取非肝脏疾病死亡的正常肝组织10例作对照. 肝活检标本均常规用40 g/L中性甲醛固定, 石蜡包埋. 兔抗人多克隆抗体TNF-α, NF-κB原位杂交检测试剂盒均购自博士德生物工程有限公司, 细胞凋亡检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司.

1.2 方法

石蜡切片常规脱蜡、水化后, 过氧化物酶阻断、孵育, 加TNF-α多克隆抗体(工作浓度分别1: 80), 再加生物素标记的第2抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液, 室温孵育, 经DAB显色, 苏木素复染, 中性树胶封片. 石蜡切片常规脱蜡至水, 过氧化物酶阻断, 加胃蛋白酶消化液暴露核酸片段30 min, 余按NF-κBmRNA原位杂交检测试剂盒说明书逐步进行. 石蜡切片常规脱蜡、水化后, PBS漂洗, 3 ml/L H₂O₂甲醇封闭内原性过氧化物酶活性, 加通透性液(1 g/L TritonX-100溶解于0.1%柠檬酸钠)和TUNEL反应混合液、Converter POD, DAB显色, 显微镜下观察肝细胞凋亡. 阳性对照为1例已知阳性的重型肝炎肝组织. 阴性对照: 用正常肝组织按以上方法分别检测TNF-α, NF-κBmRNA和细胞凋亡. 并用缓冲液分别代替TNF-α多克隆抗体, NF-κBmRNA探针及TDT(末端脱氧核酸转移酶)进行对照检测. TNF-α阳性结果为细胞膜和(或)细胞质内出现棕黄色颗粒. NF-κBmRNA阳性结果为细胞核内出现棕黄色颗粒. 原位凋亡的阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒.

统计学处理 采用SPSS11.0统计分析软件进行χ²检验、四格表确切概率法、Spearman相关分析. 以P<0.05为差异有显著性.

2 结果

2.1 肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA检测

在10例正常肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA仅有少量的表达, 而在病毒性肝炎组织中的阳性表达率均明显高于正常肝组织(P<0.01, 表1). TNF-α在肝细胞核及细胞质均有不同程度的表达, 呈弥漫型、灶型、片簇状分布于肝小叶内, 少部分在胆管上皮细胞内表达, 不少尚伴炎细胞浸润和肝细胞坏死. NF-κBmRNA活化后在细胞核表达, 阳性细胞主要在肝小叶内、汇管区, 呈点状分布. 连续切片发现部分病例TNF-α, NF-κBmRNA在肝细胞同一区域表达, 这些部位的肝细胞损害多较重. 但TNF-α阳性肝细胞分布比NF-κBmRNA阳性肝细胞分布更广泛、弥漫、阳性程度稍强(图1, 2).

表1 病毒性肝炎肝组织中TNF-α, NF-κBmRNA的表达n(%).

肝组织学	n	TNF-α阳性		NF-κBmRNA阳性
		n	%	n	%
慢性肝炎	65	50	76.9b	46	70.3b
正常肝	10	2	20.0	1	10.0

^bP<0.01 vs正常肝.

图1 TNF-α在肝组织中的表达(SP×400). A: 正常; B: 慢性肝炎.

图2 NF-κBmRNA在肝组织中的表达(原位杂交×400). A: 正常; B: 慢性肝炎.

2.2 肝细胞凋亡与TNF-α、NF-κBmRNA表达的关系如表2

表2 TNF-α、NF-κBmRNA表达与肝细胞凋亡的关系.

TUNEL	n	TNF-α阳性1				NF-κBmRNA阳性2
		-	+	++	+++	-	+	++	+++
-	22	9	2	7	4	10	4	2	6
+	15	1	3	5	6	4	4	5	0
++	16	2	1	6	7	5	5	5	4
+++	12	3	0	4	5	0	0	5	7
合计	65	15	6	22	22	19	13	17	17

¹r_s = 0.267, P<0.05;

²r_s = 0.362, P<0.05.

TNF-α、NF-κBmRNA表达均与肝细胞凋亡密切相关(^aP<0.05). 在43例肝细胞凋亡患者中, 同时伴单纯TNF-α, NF-κBmRNA阳性者分别为37例(86.0%)、34例(79.1%). 在正常的肝组织中可见少量发生凋亡的细胞. 各种不同类型肝炎肝细胞均有不同程度凋亡. 凋亡的细胞表现为胞膜完整、核改变, 见核固缩及染色质边聚. 凋亡细胞多位于坏死区周边, 变性坏死区内可见凋亡小体, 凋亡小体也呈阳性着色, 肝小叶内也有散在分布(图3).

图3 肝凋亡细胞TUNEL×400. A: 正常肝组织; B: 慢性肝炎.

2.3 TNF-α, NF-κBmRNA表达程度与炎症、纤维化的关系

如表3所示: TNF-α的阳性表达程度随着炎症活动度、肝纤维化程度的加重而增高, 并与炎症坏死区和纤维化分布区域相一致, 但经统计分析无显著差异. NF-κBmRNA表达程度随炎症活动度、纤维化程度的加重而增高, 经统计分析各组之间有显著差异(P<0.05).

表3 TNF-α、NF-κBmRNA的表达与炎症和纤维化的关系(n, %).

		n	TNF-α阳性		NF-κBmRNA阳性a
			n	%	n	%
炎症:	G1	42	29	69.0	24	54.8
	G2	21	19	90.5	20	95.2
	G3	2	2	100	2	100
纤维化:	S0	38	25	65.8	20	50.5
	S1	16	14	87.5	15	93.4
	S2	3	3	100	3	100
	S3	4	4	100	4	100
	S4	4	4	100	4	100

^aP<0.05.

2.4 TNF-α, NF-κBmRNA在病毒性肝炎中的表达关系

TNF-α, NF-κBmRNA之间均有明显的相关性(P<0.05, 表4).

表4 TNF-α, NF-κBmRNA在病毒性肝炎中的表达关系.

NF-κBmRNA表达	TNF-α表达情况		合计
	阳性	阴性
阳性	39	7	46
阴性	11	8	19
合计	50	15	65

P<0.05.

3 讨论

TNF-α是由单核巨噬细胞产生的内源性细胞因子, 其生物学效应是通过其受体TNFR1而产生[4], 其产生的信号传导途径有2条[5]: (1)是fas相关蛋白死亡域(FADD)介导的细胞凋亡; (2)通过TNF受体相关死亡域-TNF受体相关因子(TRAF2)激活核转录因子NF-κB抑制凋亡, TNFR2则通过不同于TNFR1但在某些环节可发生交叉反应的信号传导途径激活NF-κB, 使细胞增殖分化[6]. 本结果显示, 在病毒性肝炎肝组织中, TNF-α, NF-κBmRN的表达明显高于正常肝组织, 且表达程度随炎症活动度、肝纤维化程度加重而增高, 尤其在汇管区周围、肝小叶内碎屑、桥接、灶状坏死区更明显, 这与张启华et al[7]的发现一致. 我们还发现, TNF-α, NF-κBmRN在组织炎症、坏死区域分布基本一致, 这些部位的肝细胞损害多较重, 并且二者的表达呈显著相关性. 提示慢性肝病中由于多种炎症因子的诱导作用, 使NF-κB的活性持续存在, 且在肝炎病毒等因素的诱导下, TNF-α与其相应的配体结合后, 在诱发细胞凋亡的同时激活细胞内NF-κB, 从而参与肝脏的急慢性炎症或纤维化过程. 本研究显示: TNF-α的表达虽与炎症活动度、纤维化程度无统计学意义, 却反映出了表达的特点, 说明TNF-α可作为急性期反应因子参与病毒性肝炎免疫病理及炎症过程, 直接造成肝损伤, 在肝纤维化的发生、发展中占重要地位.

在病毒感染所造成的肝损害机制中, 肝细胞的异常凋亡是主要机制之一. 本资料显示, 在肝细胞凋亡较强的部位多有TNF-α, NF-κBmRN的表达, 且随肝细胞凋亡表达的增高而增加. 经原位凋亡检测发现, 凋亡细胞多位于坏死区周边, 变性坏死区内可见凋亡小体, 肝小叶内也有散在的分布, 并有大量炎细胞浸润. 并且病变早期以肝细胞凋亡为主, 病程中后期肝细胞凋亡和坏死共存. 说明肝细胞凋亡发生时常伴有肝细胞坏死, 二者均可以引起肝损伤. 正常情况下凋亡细胞的清除不伴随炎症反应. 本资料显示, 在慢性肝炎的肝组织中, 肝细胞炎症活动度越强, 凋亡细胞也越多. 提示炎症反应和凋亡并不是孤立的, 说明如果凋亡足够抗拒被清除的过程, 肝细胞凋亡可激发炎症和/或坏死. Leist et al[8-9]认为TNF-α诱导肝细胞凋亡可能是肝组织损伤的重要启动因素, 当大量凋亡的肝细胞不能为吞噬细胞清除时, 中性粒细胞受到内原性递质TNF-α的吸引而移动至肝脏, 并受到没有被迅速清除的凋亡细胞的激活, 中性粒细胞的激活可能是引起肝细胞坏死的最后过程. 另一方面可能是由于TNF-α介导的肝细胞凋亡尚有其他因素影响, 如NF-κB因子等. 但TNF-α如何启动对细胞凋亡的促进或抑制的机制尚不清楚.

在转基因动物模型的研究中发现, TNF-α可抑制HBV DNA的复制和核心蛋白的表达, 诱导肝细胞凋亡, 用抗TNF-α单抗可以阻断其凋亡[10]. Lang et al[11-12]研究TNF-α对已激活的HSC可产生凋亡诱导, 此作用能被下游效应物NF-κB所阻断. 加强TNF-α介导的HSC细胞凋亡机制的研究, 阻断TNF-α诱导的凋亡信号的传导, 可防止肝细胞凋亡和坏死, 有助于指导未来抗纤维化的治疗方案.

目前认为NF-κB主要通过以下三条途径来抑制细胞凋亡: (1)NF-κB通过调控IL-6、IL-8、TNF-α这些炎症因子的基因表达而间接抑制自身及其他细胞凋亡; (2)NF-κB[13]通过诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡. Wang et al[14]发现NF-κB能够激活Bcl-2家族中的Al/Bfl而抑制由TNF-α引起的细胞凋亡. 其机制主要是NF-κB作用于Caspase-3和线粒体的上游, 并能阻止细胞色素C从线粒体中释放. 细胞色素C是Caspase-3激活的促发因素, 是凋亡调控中的关键环节; (3)NF-κB通过诱导TRAF和IAP抑制凋亡[15]. 依据NF-κB抑制凋亡的理论并以之作为靶点, 导入其抑制性基因IKBs, 通过抑制NF-κB活性而增加HSC凋亡, 将成为今后病毒性肝炎、肝纤维化治疗的新途径.

备注

编辑: 张海宁 电编: 潘伯荣

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