雷公藤内脂醇对大鼠重症急性胰腺炎的治疗作用

摘要

目的: 探讨NF-κB在重症急性胰腺炎(SAP)发病中的作用及雷公藤内脂醇对SAP的治疗作用.

方法: Wistar大鼠90只, 随机分为三组: 重症急性胰腺炎组(P组), 雷公藤内脂醇治疗组(T组), 假手术组(S组). 每组30只. SAP模型由5%牛磺胆酸钠大鼠胆胰管逆行注射诱发而成. 模型成功后, P组不做处理; T组立即行雷公藤内脂醇(0.05 g/L)腹腔注射0.2 mg/kg; S组仅开腹, 不做其他处理. 各组于术后2、6、12 h三个时间点处死大鼠, 每次10只. 各时间点测血清淀粉酶(AMY), TNF-α、IL-6水平; 取胰腺组织行病理检查并测胰腺组织和血淋巴细胞NF-κB活性.

结果: AMY P组术后各时间点均明显升高 (P组: 47 961.76± 11 196.41, 48 768.09±8 699.41, 64 025.30±10 413.25 nKat/L; S组: 11 196.07±2 363.64, 10 156.20±1 780.02, 9 987.50±3 114.79 nKat/L, P<0.01), 在术后12 h点 T组低于P组( 64 025.30±10 413.25 vs 47 196.94±9 278.36 nKat/L, P<0.01)血清TNF-α、IL-6水平随SAP病情的进展而升高, P组及T组术后各时间点均较S组高其水平T组低于P组(S组: 0.63±0.07, 30.48±9.16, 0.67±0.14, 25.71±5.87, 0.84±0.12, 36.98±12.38 pg/L; P组: 1.12±0.14, 69.38±19.32, 1.34±0.14, 106.65±18.97, 1.60±0.41, 168.40±43.59 pg/L; T组0.88±0.19, 35.64±11.81, 0.82±0.20, 69.38±14.37, 0.92±0.19, 67.04±23.21 pg/L, P<0.01); 血淋巴细胞及胰腺组织NF-κB活性术后2、6 h P组及T组均升高(P组: 60.73±3.54, 70.77±3.56, 70.05±3.77, 80.03±3.94%; S组: 10.67±2.84, 10.27±2.53, 10.90±2.51, 12.96±2.53%; T组: 31.54±3.59, 30.57±3.54, 39.36±3.43, 40.37±3.51%, P<0.01); 胰腺病理损害光镜及电镜下T组明显轻于P组.

结论: NF-κB可能参与了大鼠SAP发病过程; 雷公藤内脂醇可以通过抑制NF-κB活性, 减少炎症递质的释放, 从而减轻SAP病理损害.

关键词: 重症急性胰腺炎; NF-κB; 大鼠; 雷公藤内脂醇

Triptolide treatment of severe acute pancreatitis in rats

Shui-Jun Zhang, Wen-Long Zhai, Yong-Fu Zhao, Chang-Ju Zhu, Zhong-Yue Deng

Shui-Jun Zhang, Wen-Long Zhai, Yong-Fu Zhao, Chang-Ju Zhu, Zhong-Yue Deng, Department of General Surgery , The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zheng Zhou 450052, Henan Province, China

Correspondence to: Shui-Jun Zhang Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, 1 Jianshe Road, Zhengzhou, Henan Province, 450052, China. zhangshuijun@zzu.edu.cn

Received: January 17, 2005
Revised: January 28, 2005
Accepted: February 2, 2005
Published online: April 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the role of NF-κB activation in the development of severe acute pancreatitis (SAP) and the therapeutic effect of triptolide.

METHODS: Ninety Wistar rats were randomly allocated into three groups: sham operation group (group S), pancreatitis group (group P), and triptolide group (group T). There were 30 rats in each group. Rats in group S only received abdomen opening surgery. SAP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate to the pancreatic duct. After model was established, no treatment was given in group P. Triptolide (0.05 mg/mL) was given by intraperitoneal injection at 0.2 mg/kg in group T. Rats were killed 2 h, 6 h, and 12 h (10 rats for each time point). after operation to determine the serum levels of amylase (AMY), TNF-α and IL-6. The pancreas tissues were obtained to examine the changes with microscope. Blood lymphocyte smear and pancreatic tissues were prepared to detect the activity of NF-κB.

RESULTS: Serum AMY Levels in group P were higher than those in group S after operation (P: 47 961.76±11 196.41, 48 768.09±8 699.41, 64 025.30±10 413.25 nKat/L; S: 11 196.07±2 363.64, 10 156.20±1 780.02, 9 987.50±3 114.79 nKat/L, P<0.01). Serum AMY Levels were significantly lower in group T than those in group P 12 h after operation (64 025.30±10 413.25 vs 47 196.94±9 278.36 nKat/L, P<0.01). At the three time points, the levels of TNF-α and IL-6 in group P and T were significantly increased compared to those in group S. In group T, they were significantly decreased compared to those in group P at the three time points (S: 0.63±0.07, 30.48±9.16, 0.67±0.14, 25.71±5.87, 0.84±0.12, 36.98±12.38 pg/L; P: 1.12±0.14, 69.38±19.32, 1.34±0.14, 106.65±18.97, 1.60±0.41, 168.40±43.59 pg/L; T: 0.88±0.19, 35.64±11.81, 0.82±0.20, 69.38±14.37, 0.92±0.19, 67.04±23.21 pg/L, P<0.01). Activity of NF-κB in pancreatic tissue and blood lymphocyte was increased 2 h and 6 h after operation in group P and group T. In group T, activity of NF-κB was significantly decreased compared to that in group P 2 and 6 h after operation(P: 60.73±3.54, 70.77±3.56, 70.05±3.77, 80.03±3.94%; S: 10.67±2.84, 10.27±2.53, 10.90±2.51, 12.96±2.53%; T: 31.54±3.59, 30.57±3.54, 39.36±3.43, 40.37±3.51%, P<0.01). Pancreatic pathological damages were much milder in group T than those in group P under microscope.

CONCLUSION: NF-κB plays an important role in the development of SAP. Triptolide can inhibit NF-κB activity, decrease inflammatory mediator levels, and reduce the pathological damage of the pancreas.

Key Words: Severe acute pancreatitis; NF-κB; Rats; Triptolide

0 引言

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种常见的急危重病, 其发病机制尚未完全阐明, 研究表明白细胞过度激活后引起机体炎症递质瀑布样释放, 导致机体免疫紊乱, 可能是SAP发病的基本机制之一. 同时研究表明核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)是调控机体炎症反应的总源头[1]. 目前有研究认为雷公藤内脂醇可以通过抑制NF-κB的活性抑制炎症反应. 我们通过检测NF-κB在 SAP大鼠体内的活性及炎症递质的水平变化, 探讨NF-κB在大鼠SAP发病机制中的作用, 并对SAP大鼠施以雷公藤内脂醇, 观察其治疗作用.

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar大鼠90只, 雌雄不限, 体重300±30 g, 购自河南省实验动物中心. 随机分为三组: SAP组(P组)、雷公藤内脂醇治疗组(T组)、假手术组(S组). 每组30只. P组与T组动物先制成大鼠SAP模型. SAP模型由5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)大鼠胆胰管逆行注射制备而成. 模型成功后, P组不作其他处理; T组立即行雷公藤内脂醇(福建省医科所植化室, 纯度>99.99%)腹腔注射0.2 mg/kg, 雷公藤内脂醇无菌蒸馏水配制浓度0.05 g/L. S组只开腹, 轻揉胰腺, 不作其他处理. 术后各组于2、6、12 h三个时间点处死大鼠, 每次10只.

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立(参照Aho[2]的方法, 并略有改进): Wistar大鼠术前12 h禁食, 自由饮水.10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手术台上, 备皮, 消毒, 铺无菌巾, 上腹正中做2 cm切口进入腹腔, 提起十二指肠, 显露胆胰管, 肝门部无创血管钳阻断胆管.1 mL注射器通过十二指肠侧壁, 潜行穿刺入胆胰管, 推注5%牛磺胆酸钠1 mL/kg, 推注速度0.2 mL/min, 压力约20 cm H₂O, 拨针后棉签压迫穿刺点2 min, 以免药液逆流. 推注后观察5 min, 确认大鼠脾胃之间胰腺组织出血、呈暗红色后, 去掉肝门部血管夹. 查腹腔无活动出血后关腹.

1.2.2 血清标本的采集与检测: 模型成功后, 分别按时间点处死大鼠, 开腹下腔静脉取血3 mL, 2 mL离心留置血清于-30度冰箱内保存, 1 mL以备分离血淋巴细胞. 自动生化分析仪鉴定血清淀粉酶(AMY); 放免法测血清TNF-α、IL-6. (按试剂盒说明进行, 试剂盒购自北京北免东雅生物技术研究所).

1.2.3 NF-κB活性测定: 取同一部位胰腺组织, 40 g/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 切片. 常规S-P法免疫组化染色, 抗p65单克隆抗体, 工作浓度1: 100. PBS代替一抗为空白对照. NF -κB试剂盒, 购自北京中山公司.

1.2.4 血淋巴细胞涂片制备: 使用密度梯度离心法, 抽取下腔静脉血1 mL, 加入0.5 mL生理盐水肝素液抗凝, 缓慢加在2 mL淋巴细胞分离液(购自北京中山公司)上、1 500 r/min、梯度水平离心20 min, 移液器小心移出两液面间的白色絮状物, 置换试管, 以1: 3比例加入0.1 mol/L PBS 吹洗均匀, 800 r/min离心5 min, 弃上清, 反复洗涤2-3次, 0.1 mol/L PBS适量重悬至3×10⁶, 涂片. 涂片后, 冷风快速吹干, 入40 g/L多聚甲醛中固定30 min, 蒸馏水洗冲5 min×3次, 冷风吹干, 置-20℃贮存备检.

1.2.5 进行组织切片: 血淋巴细胞SP法免疫组化操作与组织切片大体相同.

1.2.6 免疫组化结果判定: 细胞染色为棕黄色者为阳性, 定位于胞质与胞核, 高倍镜下数1 000个细胞, 计算其中阳性细胞数, 阳性率=阳性细胞数/总细胞数.

统计学处理 所有数值变异均采用(mean±SD)表示, 应用SPSS 10.0分析软件, 采用重复数据方差分析、单因素方差分析, 进行统计处理, 显著性检验水准取α = 0.05.

2 结果

2.1 血清淀粉酶变化

P组、T组血清淀粉酶水平随SAP病情的进展而升高, 各时间点淀粉酶较S组均明显升高, T组淀粉酶水平在12 h点则明显较P组降低(表1).

表1 血清AMY组间变化情况(nKat/L).

组别	n	2 h	6 h	12 h
S组	10	11 196.07±2 363.64	10 156.20±1 780.02	9 987.50±3 114.79
P组	10	47 961.76±11 196.41b	48 768.09±8 699.41b	64 025.30±10 413.25b
T组	10	40 408.08±12 443.49	41 447.95±7 300.29	47 196.94±9 278.36d

^bP<0.01 vs S组(对应时间点);

^dP<0.01 vs P组(对应时间点).

2.2 血清TNF-α、IL-6变化

P组和T组中二者水平在胰腺炎诱导后随SAP病情的进展而升高, 各时间点较S组均明显升高, T组各时间点二者水平则明显较P组降低(表2).

表2 血清TNF-α、 IL-6组间变化情况(pg/L).

组别	n	2 h		6 h		12 h
		TNF-α	IL-6	TNF-α	IL-6	TNF-α	IL-6
S组	10	0.63±0.07	30.48±9.16	0.67±0.14	25.71±5.87	0.84±0.12	36.98±12.38
P组	10	1.12±0.14b	69.38±19.32b	1.34±0.14b	106.65±18.97b	1.60±0.41b	168.40±43.59b
T组	10	0.88±0.19a	35.64±11.81a	0.82±0.20a	69.38±14.37a	0.92±0.19a	67.04±23.21a

^aP<0.05 vs p组(对应时间点);

^bP<0.01 vs S组(对应时间点).

2.3 NF-κB在三组之间的表达

正常胰腺组织和血淋巴细胞中只有少量的NF-κB活化, P组2 h、6 h可见大量的NF-κB活化, T组2 h、6 h NF-κB活化程度则显著下降(表3, 图1A-F).

图1 各组6 h NF-κB活化程度(S-P法, ×400). A-C: 血淋巴细胞; D-F: 胰腺组织. A, D: 假手术组, 活化低; B, E: 胰腺炎组, 活化增高; C, F: 治疗组, 活化降低.

表3 胰腺组织和血淋巴细胞中NF-κB(%)活性阳性率组间比较.

组别	n	2 h		6 h		12 h
		胰腺组织	血淋巴细胞	胰腺组织	血淋巴细胞	胰腺组织	血淋巴细胞
S组	10	10.67±2.84	10.27±2.53	10.90±2.51	12.96±2.53	12.61±2.08	10.09±1.43
P组	10	60.73±3.54b	70.77±3.56b	70.05±3.77b	80.03±3.94b	15.27±1.29	12.60±1.33
T组	10	31.54±3.59d	30.57±3.54d	39.36±3.43d	40.37±3.51d	13.47±1.95	12.50±2.14

^bP<0.01 vs S组(对应时间点);

^dP<0.01 vs p组(对应时间点).

2.4 胰腺组织病理变化

大体观察: S组各时间点胰腺组织呈色粉红, 无充血水肿, 腹腔无腹水, 小肠及其系膜正常, 无皂化斑; P组2 h后见胰腺组织水肿、灶状或成片状出血坏死灶, 色黑紫, 与周围有粘连, 胰腺组织高度肿胀. 腹腔内有血性腹水约2-3 mL.6 h时见胰腺高度水肿、苍白、成片黑紫色坏死灶, 周围粘连, 有脓苔, 肠管胀气, 胃扩张, 肠系膜充血, 肠系膜、胰腺周、肾周及后腹壁见大量灰白色、成片或点状皂化斑, 腹腔内大量混浊血性腹水, 12 h见与较6 h组更严重, 胰腺大部分出血坏死, 周围明显粘连, 脓性分泌物较多, 皂化斑更明显, 腹水变成脓血性. T组6、12 h大体可见病理损害均较相应胰腺炎组减轻, 皂化斑明显减少, 胰腺水肿、坏死均有所减轻. 光镜下: S组各时间点胰腺结构完整, 小叶无坏死、出血及炎细胞浸润, 腺泡正常; 胰腺炎组光镜下见胰腺水肿、炎细胞浸润、腺泡坏死及脂肪坏死、出血灶, 以模型成功后6、12 h明显; T组相应时间点较P组均有所减轻(图2A-C).

图2 各组12 h胰腺组织病理变化(HE×200). A: 假手术组; B: 胰腺炎组; C: 治疗组.

3 讨论

Satoh et al[3]研究显示, 在急性重症胰腺炎的早期, NF-κB在患者外周血中显著活化, 从而认为NF-κB的高表达是一项急性胰腺炎患者合并全身炎症反应综合征的危险因素之一. Altavilla et al[4]利用敲除NF-κB基因的小鼠制作成雨蛙肽诱导的胰腺炎小鼠, 发现基因敲除小鼠与正常小鼠在同样条件诱发胰腺炎时, 其TNF-α在组织中的含量、胰腺的组织损伤程度明显减轻. 我们发现大鼠SAP诱发后, 血淋巴细胞和胰腺组织中的NF-κB明显激活, 血清指标TNF-α, IL-6、AMY等亦显著升高, 胰腺组织出现明显损伤, 且随时间变化而渐严重, 与TNF-α, IL-6的水平相一致. 当NF-κB活化程度降低时, 血清指标TNF-α, IL-6、AMY等亦明显降低, 胰腺组织损伤减轻. 这表明NF-κB活化程度与SAP时炎症递质、胰腺的功能与形态变化有一致性. 但NF-κB活化程度与血清TNF-α, IL-6高峰时间不同, 这可能是NF-κB从胞质进入胞核后, 与特定的DNA片段结合, 导致炎症递质基因水平的转录, 故炎症递质高峰要落后于NF-κB的活性高峰. 在本实验中, 除血淋巴细胞中NF-κB的活性明显增强, 胰腺组织中NF-κB高表达, 表明作为炎症靶器官的胰腺组织在受到刺激后也能大量产生炎症递质. 血中淋巴细胞及胰腺组织所产生的大量的炎症递质, 通过各种途径引起机体细胞因子网络紊乱, 造成机体损伤, 同时他们再激活机体其他的细胞释放大量的炎症递质, 导致机体炎症递质的瀑布样释放, 使胰腺在原有损伤的基础上导致了更为严重的损害甚至引起多器官功能不全综合征(MODS). 这表明机体NF-κB可以通过炎症递质参与了SAP时胰腺损害. 血清与胰腺组织当中的炎症递质共同作用使胰腺炎病变向不可逆发展.

雷公藤是雷公藤植物纯化制剂, 抗炎和免疫抑制作用较强, 能够抑制TNF和IL-1、IL-6、IL-8等炎症递质的产生, 抑制吞噬细胞的吞噬功能[5-9], 金枕 et al[10]观察雷公藤多甙对急性坏死性胰腺炎免疫调节作用的实验中发现, 雷公藤多甙可以减轻急性坏死性胰腺炎血清内毒素、TNF-α, IL-1水平, 胰腺光镜下病理学评分的好转, 电镜下细胞损伤的减轻. 推测可能是雷公藤多甙阻断了炎症递质的级联效应, 阻止了SAP的发生和发展. 王贵明et al[11]在另外一项研究中也发现丹参与雷公藤多甙联合治疗急性坏死性胰腺炎时, 可显著降低血清淀粉酶、抑制炎症细胞因子的过度生成, 组织受损程度明显减轻. 雷公藤内脂醇是雷公藤植物主要活性成分之一, 也是雷公藤多甙主要活性成分之一. 后来研究发现雷公藤内脂醇的这些作用与能够抑制细胞内NF-κB的活性有关[12-15]. 我们应用雷公藤内脂醇后, 胰腺与血淋巴细胞中NF-κB活性及炎症递质如TNF-α、IL-6水平大幅度降低. 这表明, 雷公藤内脂醇在大鼠体内能够抑制NF-κB活化, 阻止NF-κB从胞质进入胞核, 减少SAP大鼠体内炎症递质如TNF-α、IL-6等大量释放, 减轻SAP的损伤. 说明雷公藤内脂醇对大鼠SAP有治疗作用, 其机制可能是通过抑制NF-κB活化, 减少炎症递质释放. 因此雷公藤内脂醇有望成为临床上治疗SAP的有效药物之一.

备注

编辑: 张海宁

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