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世界华人消化杂志. 2005-04-15; 13(8): 984-987
在线出版日期: 2005-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i8.984
氧化苦参碱对肝纤维化大鼠Smad基因表达的影响
曾维政, 吴晓玲, 蒋明德
曾维政, 蒋明德, 成都军区总医院消化内科 四川省成都市 610083
吴晓玲, 重庆医科大学附一院消化内科 重庆市 400016
曾维政, 男, 1961-12-20生, 湖南省邵阳市人, 汉族. 主任医师, 教授, 第三军医大学研究生导师. 主要从事肝纤维化防治的基础与临床研究.
基金项目: 成都军区"十五"医药科研基金课题, NO. 01A009
通讯作者: 曾维政, 610083, 四川省成都市天回镇, 成都军区总医院消化内科. zengweizheng@163.com
电话: 028-83577558
收稿日期: 2005-02-14
修回日期: 2005-03-01
接受日期: 2005-03-03
在线出版日期: 2005-04-15

目的: 研究氧化苦参碱(oxymarine, 苦参素)对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织Smad基因表达的影响.

方法: SD大鼠90只分为正常对照组(C组)、模型组(M组)和苦参素干预组(T组). CCl4 sc诱导大鼠肝纤维化, 干预组大鼠在造模的同时给予苦参素注射液ip, 正常对照组给予液体石蜡sc和生理盐水ip, 8 wk实验结束时处死动物. HE和Masson染色观察大鼠肝组织病理学变化和胶原沉积, 原位杂交和免疫组化检测Smad 4, Smad 7基因表达情况.

结果: 氧化苦参碱干预组大鼠肝半定量组织学积分(1.9±0.3 vs 3.6±0.8, P<0.05)和胶原面积(94±37 vs 691±189 μm2, P<0.05)明显减少; Smad 7蛋白表达阳性率增加[(5.09±0.68)% vs (2.86±0.86)%, P<0.05]; Smad 4蛋白表达阳性率减少[(2.33±1.64)% vs (9.56±1.34)%, P<0.05]; Smad 4 mRNA表达阳性率显著减少(0.31±0.12 vs 0.62±0.23, P<0.05); Smad 7 mRNA的表达则明显增加(0.26±0.11 vs 0.16±0.03, P<0.05).

结论: 氧化苦参碱能抑制Smad 4基因表达, 促进Smad 7基因表达.

关键词: 氧化苦参碱; Smad; 肝纤维化; 四氯化碳
引文著录: 曾维政, 吴晓玲, 蒋明德. 氧化苦参碱对肝纤维化大鼠Smad基因表达的影响. 世界华人消化杂志 2005; 13(8): 984-987
Effect of oxymarine on Smad gene expression in CCl4-induced hepatic fibrosis in rats
Wei-Zheng Zeng, Xiao-Ling Wu, Ming-De Jiang
Wei-Zheng Zeng, Ming-De Jiang, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chengdu Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
Xiao-Ling Wu, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China
Supported by Medical Scientific Foundation of Chengdu Command, NO.01A009.
Correspondence to: Wei-Zheng Zeng, General Hospital of Chinese PLA Chengdu Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China. zengweizheng@163.com
Received: February 14, 2005
Revised: March 1, 2005
Accepted: March 3, 2005
Published online: April 15, 2005

AIM: To study the effect of oxymatrine in the prevention of experimental hepatic fibrosis in rats induced by chronic administration of CCl4, to evaluate its effect on gene expression of Smad 4, Smad 7, and to explore its potential anti-fibrotic mechanism.

METHODS: Healthy male SD rats were randomly divided into three groups: the normal group (n = 10), the oxymarine treatment group (n = 40) and the fibrosis group (n = 40). Hepatic fibrosis was induced by subcutaneous injection of CCl4 (300 mL/L, 3 mL/kg, twice per wk for 8 wks). The rats in the treatment group received celiac injection of oxymatrine at 10 mg/kg twice a week. The deposition of collagen was examined with Masson staining. Gene expression of Smad 4 and Smad 7 was detected by in situ hybridization (ISH) and immunohistochemistry (IH), respectively. The data were analyzed with specific software.

RESULTS: Reduction of collagen deposition and rearrangement of the parenchyma were noted in oxymatrine-treated rats. The semi-quantitative histological scores (1.9±0.3 vs 3.6±0.8, P<0.05) and average area of collagenous fibre [(94±37) μm2vs (691±189) μm2, P<0.01] in treatment group were decreased. The expression of Smad 7 was increased, whereas the expression of Smad 4 was decreased considerably in treated animals. The positive rate of Smad 4 mRNA (0.31±0.12 vs 0.62±0.23, P<0.05) and Smad 4 protein [(2.33±1.64)% vs (9.56±1.34)%, P<0.05] were lower in treatment group. In contrast, the positive rate of Smad 7 mRNA (0.26±0.11 vs 0.16±0.03, P<0.05) and Smad 7 protein [(4.27±0.43)% vs (2.86±0.86)%, P<0.05] were increased considerably in treated animals.

CONCLUSION: Oxymatrine can promote the gene expression of Smad 7 and inhibit the expression of Smad 4.

Key Words: Oxymatrine; Smad; Hepatic fibrosis; CCl4
0 引言

氧化苦参碱(苦参素, oxymatrine)是从苦参及同属(豆科槐属)植物如广豆根和苦豆子等植物中提取出来的主要活性成分, 具有保护肝细胞、抗乙肝病毒、调节免疫等多种功效[1], 还具有良好的抗肝纤维化作用[2-5], 是肝病用药中极具前途的临床药物. 观察氧化苦参碱对CCl4诱导纤维化大鼠肝脏Smad 4, Smad 7基因表达的影响, 从分子水平探讨氧化苦参碱干预实验性大鼠肝纤维化的分子机制.

1 材料和方法
1.1 材料

质量150±10 g健康雄性SD大鼠购自华西医科大学实验动物中心. 化学纯CCl4(成都联合化工试剂研究所), 氧化苦参碱注射液(商品名博尔泰力注射液, 100 mg/支, 宁夏绿谷药业有限公司生产), Smad4, Smad7抗体及免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程公司), Smad4, Smad7探针及原位杂交试剂盒(上海申能生物工程公司).

1.2 方法

健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(C组)10只, 苦参素干预组(T组)40只, 模型对照组(M组)40只, 各组间暴露因素无差别(P>0.05). 用300 mL/L CCl4石蜡油溶液, 3 mL/kg sc, 每wk 2次, 共8 wk诱导大鼠肝纤维化模型. 氧化苦参碱干预组在造模的同时给予50 g/L注射液, 10 mg/kg, ip, 每wk 2次, 共8 wk, CCl4模型组造模同时予生理盐水ip, 正常对照组予等量石蜡油sc和生理盐水ip处理. 各组动物在最后一次CCl4注射后48 h处死, 取肝组织以中性甲醛溶液固定、石蜡包埋, 以多聚赖氨酸涂布的载玻片制作3 μm组织切片, 进行HE染色和Masson三重胶原染色作组织病理学检查; 免疫组织化学(SABC)方法检测Smad 4, Smad7蛋白表达水平, 原位杂交(in situ hybridization)法检测Smad 4, Smad 7 mRNA表达水平, 检测步骤参考试剂说明书进行. Smad 4 mRNA探针序列(5'→3'): Biotin-GGT GGC GTT AGA CTC TGC CGG GGC TAA CAG(1035-1064 bp, GC% = 63.33), Smad 7 mRNA探针序列(5'→3'): Biotin-GAG CTG TCC GAG GCA AAA GCC ATT CCC CTG(2 310-2 339 bp, GC% = 60.00), 以生物素标记探针, 碱性磷酸酶搭桥, BCIP/NBT显色反应, 光学显微镜下观察结果. 胶原纤维染色、Smad蛋白及其mRNA表达结果均使用日本Nikon TE2000-H倒置显微镜采集图像, 美国Image-Pro Plus专业图像软件分析系统专进行数据采集.

统计学处理 胶原面积、IH, ISH表达阳性率均以mean±SD表示, Excel 2000统计软件进行t检验分析.

2 结果
2.1 肝组织病理学改变

正常肝组织肝小叶结构清晰, 肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列; 肝纤维化模型大鼠肝细胞呈广泛脂肪变性、坏死, 炎性细胞浸润以汇管区及中央静脉周围为重, 肝小叶结构破坏; Masson胶原染色见蓝色胶原纤维明显增多, 汇管区-中央静脉区纤维间隔宽大, 包绕分隔肝小叶, 部分形成假小叶, 肝纤维化组织学半定量积分为3.6±0.8; 苦参素干预性治疗组大鼠肝细胞变性、坏死较轻, 有少量纤维组织增生, 部分向小叶内伸展, 形成纤细的纤维间隔, 肝小叶结构基本完整, 肝纤维化组织学半定量积分为1.9±0.3; 计算机图像分析正常大鼠肝脏平均胶原面积为(56±21) μm2, 模型组大鼠显著增加为(691±189) μm2, 二者差异非常显著(P = 0.008, P<0.01), 苦参素干预组肝脏胶原面积则减少为(94±37) μm2, 与模型组比较差异显著(P = 0.042, P<0.05, 图1 A-B).

图1
图1 大鼠肝脏胶原染色Masson×200. A: 模型组; B: 苦参素组.
2.2 大鼠肝组织Smad 4表达

免疫组化检测显示, 正常对照组大鼠肝脏仅有个别间质细胞显示Smad 4蛋白阳性染色, 模型组大鼠肝组织Smad 4蛋白表达明显增强, 阳性染色信号呈棕黄色颗粒状, 主要位于汇管区的间质细胞胞质, 其平均表达阳性率为(9.56±1.34)%, 苦参素干预组Smad 4表达阳性率减少为(2.33±1.64)%(P = 0.008, P<0.01, 图2 A-B). 原位杂交检测显示, Smad 4 mRNA在正常对照组大鼠肝组织仅有少数间质细胞显示阳性结果, 为胞质细小的蓝紫色颗粒, 且表达强度微弱; CCl4 sc使大鼠肝脏Smad 4 mRNA表达强度明显增加, 阳性信号显示为胞质蓝紫色颗粒, 且间质细胞和肝细胞均有表达, 其表达阳性率为0.62±0.23, 苦参素注射使其减少为0.31±0.12, 二者差异显著(P<0.05).

图2
图2 大鼠肝脏Smad 4蛋白表达SABC×200. A: 模型组; B: 苦参素组.
2.3 大鼠肝组织Smad 7表达

免疫组化法于正常大鼠肝脏未检测出Smad 7阳性表达; 模型组大鼠肝脏Smad 7蛋白阳性表达稀少, 仅在汇管区见少数间质细胞显示阳性染色, 为细胞质棕黄色颗粒, 其平均表达阳性率为(3.19±1.09)%, 与正常组无显著差异(P = 0.068, P>0.05, 图3A). 苦参素干预组Smad 7蛋白阳性染色亦位于间质细胞, 其阳性率增加为(5.09±0.68)%, 与模型组比较差异显著(P = 0.026, P<0.05, 图3B). 原位杂交检测显示, CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏Smad 7 mRNA表达水平低下, 仅少许间质细胞显示阳性结果, 为胞质内蓝紫色颗粒沉着, 苦参素干预性治疗则使Smad 7 mRNA表达阳性率则由0.16±0.03增加为0.26±0.11, 与模型组比较差异显著(P<0.05).

图3
图3 大鼠肝脏Smad 7 mRNA表达ISH×200. A: 模型组; B: 苦参素组.
3 讨论

TGFβ-Smad信号传导通路是肝纤维化时主要的信号转导途径[6-8]. Smads是将TGFβ信号传导至细胞内发挥生物效应的关键分子, 目前发现有三个亚类: 受体激活Smad(R-Smad), 共用Smad(Co-Smad), 和抑制性Smad(I-Smad). TGFβ的生物效应非常广泛复杂, 其信号传导过程却比较简单[9]: TGFβ配体与胞膜表面的Ⅰ, Ⅱ型受体结合后使R-Smad(Smad 2, Smad 3)磷酸化而活化, Smad2, Smad 3再和胞质中Smad 4(Co-Smad)结合形成多聚体转位进入胞核, 与一系列转录辅激活蛋白、转录辅阻遏分子和转录因子共同结合于靶基因特定的CAGAC序列(Smad-binding elements, SBEs, Smad结合元件), 调节特定靶基因的表达. Smad 6, 7 (I-Smad)则可抑制Smads多聚体形成或抑制R-Smads磷酸化而阻止该信号转导过程. 目前对Smad信号通路的信息传导过程及其关键分子的表达状况研究不断深入[10-17], 不仅有助于进一步阐明肝纤维化的发病机制, 也为肝纤维化的防治提供了一个新的颇有希望的干预途径. Flanders[18]认为, TGFβ的大多数促纤维化效应是由Smad 3介导的, 因此, 促进抑制性分子Smad 7的过度表达或者用小分子物质halofuginone抑制Smad 3的功能将是非常有效的抗纤维化措施. 梁志清et al[19]经门静脉灌注将高滴度的反义Smad 4重组腺病毒载体导入大鼠纤维化肝脏, 结果转基因大鼠肝脏内源性Smad 4表达降低, 且肝脏Ⅰ型胶原合成减少, 表明抑制Smad 4表达有潜在的抗纤维化价值. 目前许多中药研究也开始关注对TGFβ-Smad信号传导通路的干预作用, 试图从分子水平探索中药抗肝纤维化的机制, 如张国et al[20]研究发现, 中药活血软坚方能够减少肝星状细胞合成Smad 3; 宋仕玲et al[21]则观察到复方金三莪具有促进Smad 7表达、抑制Smad 3表达的作用. 这些研究表明, 调节关键的Smad分子表达水平是行之有效的抗纤维化措施, 也是有用的疗效判定指标.

苦参碱和氧化苦参碱(苦参素)是从苦参及其同属植物苦豆子等中提取、分离出来的主要活性成分, 大量实验表明[22-25], 苦参碱及氧化苦参碱具有抑制成纤维细胞增生和Ⅲ型前胶原mRNA表达作用, 还可通过抗炎、抗病毒、抑制免疫等环节抑制肝纤维化进程. 我们选择苦参素ip干预性治疗实验性大鼠肝纤维化, 观察苦参素对肝纤维化大鼠肝组织Smads表达的影响, 探讨其抗肝纤维化疗效及可能的分子机制, 结果表明苦参素注射使大鼠肝脏Smad 4蛋白表达阳性率由9.56%下降为2.33%(P<0.05), 同时, 原位杂交法检测大鼠肝组织Smad 4 mRNA阳性率由62%减少为31%(P<0.05); Smad 7蛋白表达阳性率由2.86%增加为5.09%(P<0.05), Smad 7 mRNA阳性率则由16%增加为26%(P<0.05), 肝组织Smad蛋白与mRNA表达水平变化规律一致. 显示氧化苦参碱干预性治疗能够有效地抑制实验性大鼠肝纤维化TGFβ-Smad信号转导通路中关键的信息传导分子的基因表达, 抑制CCl4诱导的肝组织损害和肝脏胶原沉积, 使大鼠肝脏胶原平均面积由(691±189) μm2减少为(94±37) μm2(P<0.01), 这些作用可能是苦参素有效地抑制实验性大鼠肝纤维化的重要分子机制.

编辑: 张海宁 电编: 潘伯荣

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