大肠癌组织KISS-1, hOT7T175 基因表达与转移的关系

摘要

目的: 研究KISS-1, hOT7T175 基因在大肠癌组织表达及其与转移的关系.

方法: 大肠癌组织60例, 采用逆转录聚合酶链式扩增反应对KISS-1, hOT7T175 mRNA的表达进行检测.

结果: 大肠癌组织和周缘正常组织KISS-1, hOT7T175阳性表达例数相比有显著差异(P = 0.000和P = 0.037). 肿瘤Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期KISS-1阳性表达例数对比有显著差异(P = 0.020).

结论: KISS-1, HOT7T175有可能成为预计大肠癌恶性程度的一个指标.

关键词: 无

N/A

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Correspondence to: N/A

Received: January 11, 2005
Revised: January 15, 2005
Accepted: January 20, 2005
Published online: April 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

近来, KISS-1基因编码产物(被命名为metastin或Kisspetin-54)和他的同源性G-蛋白偶联受体(被命名为hOT7T175)的发现, 为KISS-1基因如何抑制肿瘤转移提供了一个新的研究线索和途径. KISS-1基因的编码产物通过与hOT7T175结合后, 抑制了肿瘤细胞的侵袭, 转移和趋化性. 我们检测60例己确诊大肠癌外科手术切除后组织中KISS-1, hOT7T175 mRNA的表达, 探讨KISS-1, hOT7T175基因是否可以作为一个预测大肠癌恶性潜能的新的生物学标记物.

1 材料和方法

1.1 材料

南方医科大学附属珠江医院普外科2003-08/2004-08己行手术切除的大肠癌新鲜标本60例, 男33例, 女27例. 年龄31-69(中位51)岁. 临床资料完整. 大肠癌分期、分型分别参照国际抗癌联盟TNM分期和Dukes分期. 临床分期中Ⅰ-Ⅱ期30例, Ⅲ-Ⅳ期30例. 组织离体后5 min癌组织和距肿瘤至少5 cm的切缘组织(均经术后病理证实, 切缘无癌细胞), 液氮速冻后置-80℃冰箱保存, 备RNA抽提.

1.2 方法

组织总RNA抽提采用TRIZOL(美国Invitrogen公司)一步法, 按说明书操作. 琼脂糖凝胶(西班牙Biowest公司)电泳检测RNA有无降解, 并测RNA样品的A260/A280比值和水平. KISS-1引物参照GenBank中发表的 NM_002256基因序列合成[1]. 扩增长度为302 bp. hOT7T175引物参照 GenBank中发表的AB051065基因序列合成[2]. 扩增长度为102 bp(表1). 反转录试剂盒(SuperScript^TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR), DNA多聚酶(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)和10 mmol/L dNTPs购自Invitrogen公司. 在无RNA酶的0.5 mL EP管中加入提取的总RNA 5 μL, 10 mmol/L dNTPs 1 μL, Oligo(dT)1 μL, DEPC水补足10 μL, 65℃ 5 min, 冰浴1 min, 加入2 μL 10×反转录缓冲液, 4 μL 25 mmol/L MgCL₂, 2 μL 0.1 mol/L DTT和4 μL无RNA酶的重组RNA酶抑制物, 混匀离心后42℃水浴2 min, 加入SuperScriptⅡ反转录酶1 μL, 混匀后42℃水浴50 min, 70℃水浴15 min, 4℃ 10 000 g离心1 min, 在做PCR反应前加入RNaseH 1 μL后置37℃水浴20 min, 将cDNA链与RNA链分离. 同时做阴性对照. KISS-1基因PCR反应条件: 94℃(3 min), 94℃(30 s), 61.2℃(30 s), 72℃(40 s), 72℃(6 min)35轮; hOT7T175基因反应条件: 94℃(3 min), 94℃(30 s), 59.4℃(30 s), 72℃(40 s), 72℃(6 min)35轮; 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 阳性表达情况(图1).

表1 Primers for KISS-1, hOT7T175.

Gene	Function	Sequence
KISS-1	Forward	CTCTGTGCCACCCACTTTG
	Reverse	TGTAGTTCGGCAGGTCCTTCT
hOT7T175	Forward	CCTGGCTCGTGCCGCTCTTCTT
	Reverse	ACGGTCCGCATCGGCTTGTG

图1 KISS-1、hOT7T175基因表达图.

统计学处理 阳性表达例数经χ²检验, 所有数据通过SPSS10.0统计软件处理.

2 结果

大肠癌组织阳性KISS-1表达17例(28%), 周缘正常组织37例(62%), 二者对比有显著差异(P = 0.000). 大肠癌组织阳性hOT7T175表达19例(32%)、周缘正常组织35例(58%), 二者对比有显著差异(P = 0.037). 并且在同一标本, 无论是癌组织还是周缘组织, KISS-1的表达往往伴随着hOT7T175表达(14 vs 33), 说明KISS-1的表达与hOT7T175表达有明显的相关. 在大肠癌组织中, 肿瘤分期位于Ⅰ期和Ⅱ期KISS-1阳性表达例数为13例, Ⅲ期和Ⅳ期的4例, 对比Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期阳性表达例数, 有显著差异(P = 0.020).

3 讨论

1996年, Lee et al[3]通过把完整的第6号染色体转移进入C8161和MelJuSo黑色素瘤细胞系, 观察到他们的转移能力95%被抑制, 但没有影响肿瘤形成. 然后, 用递减杂交技术对比非转移细胞(neo6/C8161或neo6/MelJuSo)和父系转移细胞(C8161或MelJuSo)mRNA的表达, 结果发现了一个新的有抑制转移作用的基因, 并命名为KISS-1. Ohtaki et al[4]在从事G 蛋白偶联受体配体研究中, 发现了KISS-1基因编码的54个氨基酸的羧基未端酰胺化的肽, 并命名为metastin. Kotani et al[5]预测了这个肽是来源于前激素切割酶对KISS-1蛋白的水解. Horikoshi et al[6]报告metastin在孕妇的血清含量非常高, 认为metastin可能是来源于胎盘的激素. 但是, 低水平的metastin也存在于非孕妇的血清中, 这提示在非孕妇体内, metastin可能从非胎盘组织释放并有一种内激素样的功能. metastin被证实是G蛋白偶联受体(被命名为hOT7T175[4], GPR54[5], AXOR12[7])的配体. Ohtaki et al发现metastin通过激活hOT7T175, 导致激活G蛋白的磷酸化酶C的激活, 引起了细胞内钙的增长. Sanchez-Carbayo et al[8]报道在膀胱癌, KISS-1的表达是与肿瘤的组织病理分期紧密的联系在一起的, 在转移性的膀胱癌KISS-1是完全缺失的, KISS-1的表达率提供了患者的预后信息. 提示可以通过KISS-1的表达水平来预测患者的预后. Ikeguchi et al[9]报道虽然在肝癌组织没有发现KISS-1缺失, 而且KISS-1/GAPDH的比值在肝癌组织和非肝癌组织没有明显差异, 但hOT7T175/ GAPDH比值却从非肝癌组织的0.8增加到肝癌组织0.48, 并在6个晚期肝癌发现KISS-1. hOT7T175过份表达. 提示KISS-1. hOT7T175过份表达和是和肝细胞肝癌的进展有密切的关系, 有可能KISS-1和hOT7T175过份表达是介导生长信号进入癌细胞. Lee et al[10]把转染了KISS-1的克隆注入无胸腺鼠乳腺脂肪组织中, 发现KISS-1的表达显著抑制了肿瘤的转移, 但没有影响肿瘤的形成. 何进et al[11]报告KISS-1可能是影响胃癌转移的基因之一. 乔宠et al[12]报道KISS1基因在滋养细胞表达随孕周增长而增加, 提示该基因在调控早孕滋养细胞的浸润行为中起重要作用. 本实验中, KISS-1、hOT7T175基因在大肠癌周缘正常组织的表达率明显高于癌组织, 预示着肿瘤的发生与KISS-1基因的缺失有关, 并且在同一标本, 无论是癌组织还是周缘组织, KISS-1的表达往往伴随着hOT7T175表达, 说明KISS-1的表达与hOT7T175表达有明显的相关, 且在肿瘤分期中, 位于I-II期表达率也明显高于Ⅲ-Ⅳ期的, 提示KISS-1编码产物与hOT7T175的结合, 抑制了肿瘤的侵袭和转移. 本课题运用RT-PCR方法, 通过检测大肠癌组织中KISS-1基因、hOT7T175基因RNA表达情况及相互间表达的内在关系, 表明了KISS-1可能是影响大肠癌转移的众多基因之一, 并初步探讨KISS-1基因、hOT7T175基因与大肠癌临床病理特征及转移的关系, 预示KISS-1、hOT7T175基因可能成为预测大肠癌恶性潜能的新的生物学标记物, 通过恢复和提高体内KISS-1表达有望为结直肠癌基因治疗开辟新的途径.

备注

编辑: 张海宁 电编: 潘伯荣

参考文献

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