HBsAg冲击致敏的自体DCs诱导的CIK细胞对慢性乙型肝炎的治疗作用

摘要

目的: 探讨HBsAg冲击致敏的自体DCs及其诱导的HBsAg特异性CIK细胞对慢性乙型肝炎(CHB)的治疗作用.

方法: 研究对象分为HBsAg特异性CIK细胞治疗组(特异性CIK组, 23例), 拉米夫定组(LAM组, 17例)和干扰素组(IFNα2b组, 13例), 所有病例均按标准诊断为慢性乙型肝炎(CHB), 轻度. 常规分离外周血单个核细胞, 进一步培养诱导成为HBsAg冲击致敏的DCs及HBsAg特异性CIK细胞, 分别经皮下和静脉回输. 另选LAM和IFNα2b常规治疗作为对照. 观察HBV标记物、肝功能的变化和毒副作用, 治疗结束后随访.

结果: 自体HBsAg冲击致敏的DCs及其诱导的HBsAg特异性CIK细胞可促进CHB患者HBeAg 和HBV DNA阴转, HBeAg/HBeAb的血清转换, 肝功能的恢复, 疗效高于拉米夫定治疗组(P<0.05), 与干扰素治疗组比, 无显著差异(P>0.05).

结论: HBsAg冲击致敏的DCs及其诱导的HBsAg特异性CIK细胞对CHB有治疗作用, 有临床应用前景.

关键词: 无

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: June 16, 2005
Revised: August 1, 2005
Accepted: August 20, 2005
Published online: April 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

树突状细胞(dendritic cells, DCs)作为机体免疫反应的起动子, 其摄取外源性抗原并通过MHCⅡ类途径递呈给CD4+T细胞, 也通过MHCⅠ类途径递呈内化的外源性抗原. DCs能打破机体对多种抗原的免疫耐受, 也在机体对某些抗原免疫耐受的建立过程中发挥重要的作用. 此外DCs的作用还与其细胞亚群, 成熟程度有关[1-2]. 有研究显示, 慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染中, DCs表达共刺激分子及MHCⅡ类分子明显低于正常, 同时DCs刺激T淋巴细胞增生和细胞因子分泌的能力亦低于正常, 因此, HBV感染的慢性化与DCs功能缺陷有关[3-4]. 由于DCs功能的缺陷, 进一步造成CTL功能不足, 因而, 形成HBV慢性持续性感染状态. 细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer, CIK)细胞具有非MHC限制性, 高增生活性, 高细胞毒力以及来源丰富, 回输后副反应少等优点, 在对肿瘤的治疗中已取得了明显的疗效[5]. 为终止HBV的慢性持续性感染状态, 本研究旨在观察HBsAg冲击致敏的DCs所诱导的特异性CIK细胞对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的治疗作用.

1 材料和方法

1.1 材料

我科2002-01/2003-12门诊或住院患者, 共23例, 其中男性17例, 女性6例, 平均15岁±8.3岁, 按照《病毒性肝炎防治方案》[6], 诊断为慢性CHB, 患者的平均年龄26.7岁±4.3岁, 病程5-21 a. 入选前6 mo内未接受免疫调节或抗病毒治疗, 并排除其他肝炎病毒的混合感染或重叠感染, HBsAg, HBeAg, HBV DNA定量检测均为阳性, HBV DNA水平在104copies/mL以上, 肝脏影像学证实为慢性炎症, 少部分病例同时被肝穿刺活检证实. ALT全部异常, 在正常值上限1.5-5.0倍之间; 另选同期拉米夫定治疗的患者17例和干扰素治疗的13例作为对照, 三组患者的临床资料(包括治疗前基本情况, 肝功能, 病毒学指标等)均具有可比性(P>0.05).

1.2 方法

1.2.1 分组及治疗: 拉米夫定治疗组: lamivudin(LAM, 拉米夫定, 由葛兰素史克公司提供), 0.1 g/d, 口服, 共12 mo. IFNα2b组: IFNα2b(商品名, 英特龙, 由中国深圳海王英特龙生物技术股份有限公司提供), 每次500 mU, 隔日肌肉注射, 6 mo. HBsAg冲击致敏的DC所诱导的特异性CIK细胞治疗组: 患者共抽取外周血6次, 每周回输1次, 共12次, 疗程3 mo.

1.2.2 HBsAg冲击致敏的DC及其所诱导的特异性CIK细胞的制备: 无菌条件下抽取患者外周静脉血20 mL, 肝素抗凝, 常规分离外周血单个核细胞, 用无血清培养液悬浮, 计数, 调细胞浓度为2×10⁹/L, 将其加入到6孔培养板中, 每孔3 mL, 于37℃、50 mL/L CO₂, 饱和湿度下孵育2 h, 吸出细胞培养液, 用AIM-V无血清培养液(Gibco Co.)洗涤三次, 将所收信的细胞悬液用作CIK细胞培养. 在剩余的黏附贴壁细胞中加入新鲜含1 000 kU/L rhGM-CSF, 500 kU/L rhIL-4(购自美国Peprotech Co.), 1 000 kU/L rhIL-2(美国Pharmingen Co.)的无血清培养液3 mL, 隔日半量换液并添加上述细胞因子, 培养至第7 d时加入HBsAg 20 mg/L(中国深圳康泰生物制品有限公司提供), 12 h后加入TNFα 500 μg/L, 再培养12 h收集细胞, 将部分细胞用生理盐水洗涤重悬后, SC[7], 剩下的细胞用作刺激细胞. 同时, 将前述未贴壁的单个核细胞悬液混合, 调细胞浓度为1×10⁹/L, 再加入到培养瓶中, 每瓶3 mL, 于第1 d加入rhIFNγ 1 000 U/106个细胞(美国Pharmingen Co.), 24 h后加入rhIL-2 500 U/106个细胞, rhIL-1 100 U/106个细胞(美国Pharmingen Co.), CD3McAb 500 ng/106个细胞(中国广州广兴生物工程有限公司), PHA 20 μg/106个细胞, 每2-3 d扩1次瓶, 扩瓶时添加半量培养液, rhIL-2 400 kU/L, PHA10 mg/L, 第7 d时收集细胞, 即为CIK细胞. 将前述剩余的HBsAg冲击致敏的DC和CIK细胞按1: 10比例混合, 再加入HBsAg, rhIL-1, rhIL-2, CD3McAb, PHA(剂量同前), 继续培养, 每2-3 d扩瓶1次, 至第7 d时收集细胞, 即为HBsAg冲击致敏的DC所诱导的特异性CIK细胞. 洗涤后, 生理盐水重悬, 12 h内静脉输入[8]. 所有的操作步骤均在百级超净间中进行, 严格无菌操作, 回输时保留细胞洗涤液行无菌试验.

1.2.3 观察项目及随访: (1)肝、肾功能: 采用美国Beckman全自动生化仪及其配套试剂检测; (2)HBsAg, 抗HBs, HBeAg, 抗HBe定量检测采用微粒子酶联免疫法(MEIA)检测, 仪器及试剂均由美国Abbott Co. 提供; (3)HBVDNA定量检测: 采用AG-9600荧光DNA分析检测仪, 试剂为美国Biotronis Co. 提供的荧光标记法HBV DNA定量检测试剂盒, 敏感度为106copies/L, 检测范围为10⁷-10⁸copies/L. 所有的病例均于治疗前后, 疗程结束后每2 mo检查上述项目.

统计学处理 应用SPSS10.0统计软件, 组间比较用非配对t检验, 率的比较用χ²检验.

2 结果

2.1 HBV血清标记物的变化

2003-12随访结束时, 特异性CIK治疗组中15例HBeAg阴转, 7例出现抗HBe, 其中2例分别于治疗后3 mo, 7 mo出现抗HBs, 再其中有1例HBsAg和HBsAb至今同时阳性; LAM组3例HBeAg阴转, 2例出现HBeAg/HBeAb血清转换, 无1例出现HBsAg/HBsAb血清转换; IFNα2b组5例HBeAg阴转, 3例出现HBeAg/HBeAb血清转换, 1例出现HBsAg/HBsAb血清转换. 特异性CIK组与LAM组相比, HBeAg阴转的差别有显著性(P<0.05), 和IFNα2b组相比, 则无统计学意义(P>0.05).

2.2 HBV DNA的变化

三种治疗方法, 均能促进HBV DNA阴转, 三组之间无明显不同(P>0.05), 治疗后HBV DNA反跳(再度阳性)的例数也无明显差别(P>0.05). 表1提示三种治疗方法对HBV的复制均有抑制作用.

表1 三种治疗方法对HBV DNA的影响.

组别	n	HBV DNA(-)(n)	HBV DNA(-)时间(d)	反跳(n)
特异性CIK组	23	12	167.5±56.8	5
LAM组	17	14	146.8±29.8	6
IFNa2b组	13	5	153.2±65.2	2

2.3 血清ALT的变化

治疗前血清的ALT水平, 组间差别无显著意义(P>0.05), 治疗后, 特异性CIK治疗组与LAM治疗组比, ALT复常的差别有显著性(P<0.05), 但与干扰素组比, 则无显著性(表2).

表2 三种治疗方法对血清ALT水平的影响.

组别	n	治疗前(正常上限倍数)	治疗后复常(n)	反跳(n)
特异性CIK组	23	1.2±1.7	20a	2
LAM组	17	1.5±1.3	8	3
IFNa2b组	13	1.6±1.9	10	2

^aP<0.05 vs LAM组.

2.4 不良反应

特异性CIK细胞治疗组与IFNα2b组相似, 主要为治疗初期出现流感样症状, 脱发, 外周血白细胞轻度减少, 未经特殊处理, 继续治疗过程中均可消失, 未发现过敏、自身免疫性疾病、抑郁和内分泌系统的疾病, 所有患者对治疗的耐受性和依从性良好.

3 讨论

许多研究表明, HBV感染后慢性化的原因主要与体内DCs的成熟障碍和功能缺陷有关[9]. HBV感染后, 静止期DCs的表型正常, 但其加工、处理和递呈抗原的过程发生障碍, 不能有效诱导HBsAg特异性CTL反应, 反而产生免疫耐受, 而不是T淋巴细胞的耗竭或缺失. 当输入体外激活的DCs后, 不仅能产生抗HBs, 而且能产生HBsAg特异性CTL反应[10], 而体外多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞), 具有非MHC限制性.高增生性细胞毒性能力强和来源丰富等特点, 将他与HBsAg冲击致敏的DCs共同培养, 可以诱导出HBsAg特异性CIK细胞, 以增强各自的疗效.

根椐免疫应答的原理, 我们先将体外HBsAg冲击致敏的DCs通过皮下注入体内, 使其起到抗原递呈作用, 诱导机体的免疫识别功能, 再将剩余的DCs与CIK细胞共同培养, 制备HBsAg牧民性CIK细胞, 一方面增强DCs的抗原递呈作用, T淋巴细胞对DCs的功能有促进作用; 另一方面增强CIK细胞的特异性杀伤功能. 将其回输体内后, 结果表明, HBsAg冲击致敏的DCs联合HBsAg牧民性CIK细胞治疗CHB, 其疗效比单用LAM或干扰素好, HBeAg阴转率、HBeAg/HBeAb的血清转换率、HBV DNA阴转率和血清ALT的复常率均高于LAM组, 疗效略优于干扰素治疗组(无统计学意义), 但对HBsAg无作用, 同时只有一小部分病例无效或反跳, 显示出较好的临床应用前景.

总之, 我们发现, HBsAg冲击致敏的DCs及其所诱导的HBsAg特异性CIK细胞疗法能抑制HBV的复制, 提高HBeAg阴转率和HBeAg/HBeAb的血清转换率, 促进肝功能的恢复, 疗效较好. 若能严格控制无菌操作, 则无毒副作用, 不良反应少, 具有临床应用前景, 如若能与其他抗病毒药物联合应用, 则可能进一步提高疗效.

备注

编辑: 张海宁

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