肝干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究进展

摘要

肝功能衰竭是死亡率极高的危重病, 近年来干细胞的研究为急慢性肝功能衰竭患者的治疗提供了新思路. 采用干细胞移植技术来修复、治疗急慢性肝功能衰竭患者, 帮助患者度过危险期等待肝移植或直接修复衰竭肝脏, 将是一个经济理想的方法, 现将这一领域的研究进展作一综述.

关键词: 无

N/A

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Correspondence to: N/A

Received: January 6, 2005
Revised: February 1, 2005
Accepted: February 16, 2005
Published online: April 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)在临床上极为凶险, 预后极差, 传统内科治疗难以取得良好疗效, 死亡率高达80%. 慢性肝功能衰竭也是死亡率极高的危重病. 生物人工肝、原位肝移植技术的临床应用, 使重症患者生存率已有明显改善, 但由于医学伦理学、移植供体、移植排斥反应、治疗费用等因素的限制, 尚难广泛开展, 故ALF仍是临床上最棘手的问题之一. 近年来随着干细胞研究的兴起和不断深入, 在肝衰竭治疗方面, 众多学者进行了一系列的实验及临床研究, 并取得了突破性的进展.

1 干细胞是肝脏细胞移植的最理想细胞

干细胞是机体组织器官的起源细胞, 具有自我复制、高度增生和多向分化的功能. 干细胞特有的生物学特征及潜在的生物学应用价值已成为近年来医学领域的热点课题.1999年和2000年干细胞研究进展两次被science评选为年度世界十大科学进展之首, 大量的研究证明干细胞移植技术是一些难治性血液病和免疫性疾病治愈的唯一希望.

肝功能衰竭是多种急慢性肝病导致的临床综合征, 急性肝功能衰竭虽经内科综合性治疗, 死亡率仍高达80%, 慢性肝功能衰竭也是死亡率极高的危重病. 肝移植对肝衰竭的治疗有效, 但供体短缺及免疫排斥问题难以解决. 目前的血液净化技术只能代替肝脏的部分解毒功能, 疗效并不令人满意. 生物型人工肝支持系统不但具有解毒功能, 还具有肝脏的代谢与生物转化等其他功能, 是比较理想的人工肝脏. 但是目前生物型人工肝的肝细胞来源主要采用经胶原酶分离的原代猪肝细胞, 受到欧洲学者的质疑, 且该法整体疗效有限. 采用细胞移植技术来修复、治疗急慢性肝功能衰竭患者, 帮助患者度过危险期等待肝移植或直接修复衰竭肝脏, 将是一个经济理想的方法. 实施肝细胞移植的前提和关键在于获得大量功能良好的肝细胞并且不引发移植排斥反应. 维持人体正常肝脏功能约需2.5×10¹⁰个肝细胞, 目前用于移植的细胞有成人肝细胞、胎肝细胞、异种肝细胞、肝干细胞.

一个成人肝脏可给多个受体提供肝细胞, 但总体来源有限. 胎肝细胞具有分裂增生能力强, 免疫原性弱, 移植细胞增生快等优点, 但其遗传稳定性有待进一步研究. 异种肝细胞如猪肝细胞来源广泛, 但面临免疫排斥问题. 自体肝干细胞不但具有特定的分化表型, 而且具有很强的增生性, 并且不引发移植排斥反应. 为根本解决组织工程的种子细胞提供了可能性, 是肝细胞移植的最理想细胞.

2 肝干细胞来源

肝干细胞来源倍受关注, 一般认为是多源性, 大致上分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞. Wilson和Leduc于1958年首先报道了一种的肝脏原始细胞, Farber首次将其描述为卵圆细胞, 此后许多研究证实成年哺乳动物肝脏均存在既能向肝细胞分化又能向胆管细胞分化的卵圆细胞, 即肝源性干细胞. 非肝源性干细胞包括胚胎干细胞和骨髓干细胞(造血干细胞和骨髓间充质细胞), 最近的实验研究表明[1-2], 肝卵圆细胞和骨髓干细胞有许多共同的表面标志如C-kit, CD34, Thy-1等, 在特定条件下, 造血干细胞和骨髓间充质细胞均可转化成肝细胞.

3 骨髓干细胞向肝细胞的转化

骨髓中含有多种细胞, 包括造血干细胞、间充质细胞、网状细胞、脂肪细胞及各分化阶段的血细胞. 其中造血干细胞和间充质细胞处于谱系发育的顶端, 具有较强的增生、分化能力. 造血干细胞特征性的表面标志是C-kit (+)、Lin (-)、Thy (+)、Sca-1 (+), 静脉移植后具有迅速归巢及长期增生能力. Lagasse et al[3]将骨髓组织细胞按细胞表面标志分为C-kit (-)、C-kit (+)组; Lin (-)、Lin (+)组; Sca-1 (-)、Sca-1 (+)组, 然后分别移植给致死量放射线照射受鼠, 发现只有C-kit (+)、Lin (-)、Thy (+)、Sca-1 (+)组骨髓细胞能长期重建受鼠的多谱系造血, 且在受鼠肝脏中发现上述细胞来源的成熟肝细胞, 提示受鼠部分肝细胞起源于骨髓造血干细胞, 造血干细胞可以转化为肝细胞. Krause et al[4]从接受骨髓移植的第一受鼠骨髓内提取回巢的Lin (-)细胞, 将其再移植给第二受鼠, 结果不仅重建了第二受鼠的造血功能, 而且在其多器官、组织中发现了骨髓来源的上皮细胞, 包括胆管上皮细胞, 提示造血干细胞可转化为胆管上皮细胞. Theise et al[5]将正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠体内, 应用荧光原位杂交方法检查雌性小鼠肝脏细胞Y染色体, 结果发现雌性小鼠肝脏的部分肝细胞表达Y染色体, 提示骨髓干细胞在正常的肝脏环境中能分化为肝细胞. Petersen et al[6]将雄性大鼠骨髓干细胞移植到肝损伤且肝细胞增生被抑制的雌性大鼠模型体内, 发现该模型雌性大鼠的部分肝脏细胞表达Y染色体, 提示骨髓干细胞在肝损伤且肝细胞增生被抑制的肝脏中能分化为肝细胞, 上述结果提示骨髓干细胞不仅在正常肝脏环境能分化为肝细胞, 而且在某些疾病肝脏环境中也能分化为肝细胞. 为了研究这一现象是否在人体内发生, Theise et al[7]研究了6例不同性别的骨髓移植和肝脏移植患者, 其中2例骨髓移植系男性供体向女性患者提供骨髓, 4例肝移植为女性供体向男性患者提供肝脏. 结果发现所有患者肝组织均见Y染色体阳性肝细胞及胆管细胞, 其中Y染色体阳性肝细胞占4%-43%, Y染色体阳性胆管细胞占4%-38%. 提示骨髓移植女患者肝组织内Y染色体阳性细胞源于男性供体骨髓, 肝移植男性患者肝组织内Y染色体阳性细胞源于自身骨髓干细胞. Alison et al[8]报道起源于骨髓的肝细胞约占全部肝细胞的0.5%-2%.

骨髓干细胞的生长、分化及转化还受到多种细胞因子的调控. 国内姚鹏et al[9]报道肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)能促进骨髓干细胞的增生、分化, 转化生长因子-β(TGF-β)能诱导骨髓干细胞的凋亡, 而肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)对骨髓干细胞的生长无明显影响.

目前推测, 当骨髓干细胞进入肝脏时, 通过黏附分子黏附到肝血管壁上, 在肝脏高浓度细胞因子的作用下, 通过信号转导机制, 使细胞转录因子按不同比例发生新的组合, 从而启动新基因的转录, 最终使骨髓干细胞的表型和功能发生变化, 经卵圆细胞进一步转化为肝细胞和胆管细胞.

4 肝干细胞移植方法

4.1 骨髓干细胞的分离方法

骨髓干细胞主要有两大类, 一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs), 他是血细胞的起源细胞, 另一类是骨髓间充质细胞(mesenchymal stem cells, MSCs).骨髓中MSCs的含量很低, 约为0.001-0.01%, 因此应用MSCs前, 需对其进行分离及体外培养扩增. 目前常用的分离方法为贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法.

贴壁筛选法是利用MSCs贴壁生长的特点, 在细胞培养时去除上清夜中的造血干细胞、网状细胞、脂肪细胞等骨髓其他细胞, 筛选扩增出MSCs. 流式细胞仪分选是目前分离骨髓干细胞的最常用方法之一. 其主要原理是根据骨髓干细胞表达或不表达某些细胞表面标志, 采用相应的荧光素标记抗体进行免疫染色, 根据阳性、阴性选择原理, 获得具有特定表面特征的细胞. 一般认为, 造血干细胞表达CD34、CD117、CD45、AC-113、Thy-1等表面标志; 骨髓间充质细胞表达高水平的CD13、CD29、CD90、CD100、CD166、CD49b和SH2、SH3, 表达低水平的CD44、CDW90、KDR、FH1, 不表达CD10、CD31、CD34、CD36、CD38. Goldschneider et al[10]首次证实采用流式细胞仪通过选择Thy(+)细胞初步分离出骨髓细胞, 但骨髓细胞包括淋巴细胞、红细胞、单核细胞、粒细胞及未分化细胞等, 而干细胞存在于未分化细胞群中, 由于淋巴细胞、红细胞、粒细胞占骨髓细胞总数的90%以上, 因此分离骨髓干细胞的关键在于去除这三种细胞. Shah et al[11]先用红细胞裂解液去除大鼠骨髓细胞中的红细胞, 然后将剩余细胞与小鼠抗大鼠CD3及CD45RA抗体作用并置于抗小鼠免疫球蛋白铺层的培养皿中以去除T、B淋巴细胞, 电镜下检查该方法分离的细胞为造血干细胞, 但此法没有去除骨髓细胞中的粒细胞. 展玉涛et al[12]报道先用红细胞裂解液去除大鼠骨髓细胞中的红细胞, 再通过流式细胞仪分选Thy⁺、CD45RA^-、CD3^-细胞来富集骨髓干细胞, 并将富集骨髓干细胞经大鼠门静脉进行自体移植获得成功. 蔡云峰et al[13]采用免疫磁珠分离方法分离β2-M和Thy+ CD34的骨髓干细胞, 进行体外培养, 诱导分化后, 能检测到白蛋白、AFP、CK8/18等肝细胞标记的表达, 表明此法行骨髓干细胞的分离也可成功.

4.2 肝干细胞植入的部位

4.2.1 腹腔内移植: 腹腔内移植具有空间大易操作及营养物质、代谢产物的交换表面积大等优点, 但此法存在以下缺点: (1)腹腔内移植肝细胞增加了炎症反应和细菌感染的可能性, 可引起腹膜炎、腹腔内粘连等并发症. (2)腹腔内移植血管形成需要较长的时间, 限制了其在急性肝衰竭中的应用. (3)腹腔内激活酶的溶解作用可影响移植肝细胞的活力. 即使通过使用微载体系统将细胞包裹于生物活性物质中, 延长移植肝细胞的存活时间, 但由于包裹物质易被吸收, 肝细胞的存活时间仍很有限.

4.2.2 脾内移植: 脾内移植的肝细胞具有良好的生理功能和长期的存活率, 实验观察发现: (1)移植肝细胞在脾脏的红髓增生成窦状进而形成肝细胞索; (2)移植肝细胞保留有正常肝细胞的超微结构特征; (3)移植肝细胞能分泌白蛋白, 分解胆红素. 因此脾脏可能是肝细胞移植的理想部位.

4.2.3 门脉或肝内移植: 从理论上讲肝脏本身是肝细胞移植的最佳器官, 因为门脉内含高浓度的嗜肝细胞因子和局部生长因子. 多个门脉内输注的研究显示, 移植肝细胞可在不改变器官微结构的情况下与受体肝实质相融合. 通过选择某一叶的门静脉属支进行移植, 可以避免栓塞所引起的并发症.

5 肝干细胞移植在肝衰竭中应用

我国重型肝炎、急性肝功能衰竭发生率较高, 其病理特点是大块或亚大块肝细胞坏死, 而残存肝细胞的增生受到多种因素的抑制, 依赖病变肝脏自身能力引发肝再生有很大困难. 原位肝移植技术由于供体的数量、昂贵的价格以及高手术并发症发生率、病死率等因素, 而大大受限. 利用骨髓干细胞等具有一定生长或生存优势的肝干细胞进行细胞移植以治疗此类患者或者通过建立以自身骨髓干细胞分化增生的肝细胞组成生物人工肝为异体肝移植前的治疗争取时间, 是一个极为可行的手段.

5.1 肝干细胞移植在生物人工肝中的应用前景

生物人工肝(bioartificial liver, BAL)支持系统是终末期肝病患者度过危险期或获得异体肝移植的手段之一, 生物反应器是BAL核心成分, 患者血浆在体外通过附着有大量代谢活性肝细胞的生物反应器进行循环, 给患者提供代谢支持, 生物反应器需要1×10¹⁰个以上肝细胞才可能取得理想效果, 要获取足够数量的肝细胞供临床应用相当困难, 猪肝细胞作为生物反应器肝细胞源在日本及北美的实验中心应用广泛, 但在欧洲国家尚存争议.骨髓干细胞具有很强的的再生能力及定向分化潜能, 提供了一个有价值的生物反应器肝细胞源. 如果将骨髓干细胞在一定条件下培养扩增, 达到一定标量后加入生长因子诱导干细胞分化成为成熟肝细胞, 再加入其他非肝实质细胞一起聚集成肝细胞族状结构, 作为肝细胞源, 完成正常肝细胞的生物功能, 将解决目前生物人工肝应用中所面临的难题.

5.2 肝干细胞移植直接治疗肝衰竭

国内石铸et al[14]报道小鼠胚肝细胞脾内移植对Wilson病动物模型TX小鼠铜代谢紊乱的改善情况. 他们通过对胚肝细胞分离纯化后, 将2×10⁶个胚肝细胞悬液注入小鼠脾脏下极, TX小鼠的血清铜蓝蛋白水平在细胞移植后逐渐升高, 且临床表现出现一定程度的改善. Lagasse et al[3]成功地使用骨髓造血干细胞挽救了延胡索酰乙酰乙酸酶缺陷(fumaroyl-acetoacetate hydrolase, FAH)小鼠. FAH小鼠因缺乏该酶可致酪氨酸血症表现为进行性肝功能衰竭及肾小管坏死而很快死亡. 他们用9只FAH小鼠为受鼠, 每只接受1×10⁶个未分离的骨髓细胞移植, 3 mo后有4只小鼠存活, 而且临床表现无明显异常, 移植7 mo后小鼠生化检查显示血清胆红素、转氨酶、各种氨基酸的水平大大优于未经处理的小鼠.

总之, 目前肝干细胞的研究尚处于起步阶段, 如何有效地分离自体肝干细胞; 微环境和细胞因子对肝干细胞的定向分化、增生有怎样的影响; 能否在体外形成具有功能的器官; 在疾病环境下这些肝干细胞能否替代病损肝脏维持正常的生理功能这些问题的最终解决将为干细胞移植治疗急慢性肝功能衰竭开辟一片新天地.

备注

编辑: 张海宁

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