基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2005. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2005-04-01; 13(7): 856-859
在线出版日期: 2005-04-01. doi: 10.11569/wcjd.v13.i7.856
回转器模拟失重对SGC-7901细胞增生和周期的影响
朱鸣, 吴本俨, 聂捷琳, 李莹辉
朱鸣, 吴本俨, 解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
聂捷琳, 李莹辉, 航天医院工程研究所第十三研究室 北京市 100094
朱鸣, 女, 1969-02-04生, 浙江省宁波市人, 汉族, 2002年军医进修学院医学硕士, 主治医师. 主要从事胃肠道免疫方面的研究.
基金项目: 总装备部预研基金项目, No. 51400020204JB1002.
通讯作者: 吴本俨, 100853, 北京市复兴路28号, 解放军总医院南楼消化科. zm6924@vip.sina.com
电话: 010-66937393
收稿日期: 2005-01-31
修回日期: 2005-02-11
接受日期: 2005-02-26
在线出版日期: 2005-04-01

目的: 探讨模拟失重对胃癌SGC-7901细胞的细胞增生和细胞周期的影响.

方法: 采用回转器模拟失重, 用免疫组化法观察SGC-7901细胞PCNA表达的变化, 并用流式细胞仪测定其细胞周期的变化.

结果: 模拟失重后12, 24, 36 h回转组PCNA抗体阳性细胞比率与对照组相比无明显差异, 48, 72 h回转组的PCNA抗体阳性细胞明显减少(P<0.05及P<0.01).12, 24, 36 h回转组的细胞周期与对照组相比无明显差异, 48, 72 h后G0+G1期细胞显著增多(P<0.01及P<0.05), S+G2+M期细胞则显著减少(P<0.01及P<0.05).

结论: 回转器模拟失重抑制SGC-7901细胞的增生, 抑制细胞G1期向S期的转化.

关键词: 模拟失重; 胃癌; 细胞增生; 细胞周期
引文著录: 朱鸣, 吴本俨, 聂捷琳, 李莹辉. 回转器模拟失重对SGC-7901细胞增生和周期的影响. 世界华人消化杂志 2005; 13(7): 856-859
Effects of rotating clinostat simulated weightlessness on cell proliferation and cell cycle of human gastric carcinoma cell line SGC-7901
Ming Zhu, Ben-Yan Wu, Jie-Lin Nie, Ying-Hui Li
Ming Zhu, Ben-Yan Wu, Department of Gastroenterology, South Building, the General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
Jie-Lin Nie, Ying-Hui Li, the 13th laboratory of Institute of Space Medico-Engineering, Beijing 100094, China
Supported by the Preparative Research Foundation of the Main Equipment Department, No. 51400020204JB1002.
Correspondence to: Ben-Yan Wu, Department of Gastroenterology, South Building, the General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China. zm6924@vip.sina.com
Received: January 31, 2005
Revised: February 11, 2005
Accepted: February 26, 2005
Published online: April 1, 2005

AIM: To investigate the effect of simulated weightlessness on cell cycle and proliferation of human gastric carcinoma cell line SGC-7901.

METHODS: A rotating clinostat was used to simulate weightlessness. The expression of PCNA was examined by immunohistochemical staining. The changes of cell cycle were examined by flow cytometry.

RESULTS: The expression of PCNA did not change significantly after 12 h, 24 h, and 36 h of simulated weightlessness, but decreased significantly after 48 h and 72 h (P<0.05 and P<0.01, respectively). The cell cycle of 12 h, 24 h, and 36 h groups did not change significantly. However, the cells in G0+G1 phase in 48 h and 72 h groups were increased significantly (P<0.01 and P<0.05, respectively), while the cells in S+G2+M phase were decreased significantly (P<0.01 and P<0.05).

CONCLUSION: Simulated weightlessness by a clinostat can prevent the transition of cells from G1 phase to S phase, and thus the proliferation of SGC-7901 cells was inhibited.

Key Words: Simulated weightlessness; Gastric cancer; Cell proliferation; Cell cycle
0 引言

太空飞行可导致骨质疏松[1]、肌肉萎缩[2]、贫血和免疫抑制[3], 这给我们带来一个疑问: 在太空中细胞的活性是否都有所下降？细胞活性的降低是否是细胞分化、细胞周期、细胞增生和细胞凋亡的结果？尤其是肿瘤细胞的活性是否也下降？以往未见对失重状态下胃癌细胞的研究, 我们把胃癌SGC-7901细胞置于回转器模拟失重的状态下, 观察其细胞增生和细胞周期的变化.

1 材料和方法
1.1 材料

胃癌细胞系SGC-7901细胞为本实验室所保存; DMEM培养基及灭活小牛血清, 由华美公司提供; MG3型回转器, 生物物理所研制; PCNA抗体、PV9000及DAB染色液, 由中山公司提供; FACSCalibur(B-D公司, 美国)型流式细胞仪.

1.2 方法

接种SGC-7901细胞60瓶(20 mL), 密度2×105/瓶, 加入DMEM培养基(含100 mL/L灭活小牛血清, 100 kU/L的双抗, 50 g/L碳酸氢钠, 调pH至7.2)5 mL.24 h待细胞完全贴壁后, 瓶中灌满培养基, 将其随机分为两组, 每组各30瓶. 一组放置在回转器(30 r/min, 37℃)中培养, 另一组正常生长作为对照. 分别在模拟失重12, 24, 36, 48和72 h后, 两组各取6瓶细胞, 取出细胞爬片, 用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗, 700 mL/L乙醇固定30 min以上, PBS清洗后, 采用二步法免疫组化检测PCNA抗体. 细胞爬片用30 mL/L过氧化氢孵育10 min, 用正常山羊血清封闭30 min, 滴加一抗, 室温过夜; TBS洗3次, 各5 min后, 滴加PV-9000, 37℃孵育30 min, DAB显色, 苏木素复染, 甘油明胶封片, 显微镜下观察. 阴性对照 用和第一抗体同比稀释的正常兔血清代替第一抗体染色. 在光学显微镜下分别计数PCNA抗体阳性细胞的密度(阳性细胞百分比). 分别在模拟失重12, 24, 36, 48和72 h后, 两组各取6瓶细胞, 以胰蛋白酶消化后离心收集细胞, 悬于1 mL 700 mL/L冷乙醇, 4℃冰箱中保存至少24 h. 测定时, 将细胞离心(1 500 r/min, 5 min)收集, 用PBS清洗后悬细胞于50 mg/L的核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)A中30 min, 再加入PI(50 mg/L)染色30 min后, 在流式细胞仪上进行细胞周期测定. 测出各周期细胞所占百分比.

统计学处理 采用t检验比较回转组与对照组间的差异.

2 结果

SGC-7901胃癌细胞形态多样、大小不一. PCNA抗体阳性细胞的胞核呈棕色, 背景清晰(图1A-B; 图2A-B; 图3A-B; 图4A-B; 图5A-B). 阴性对照切片未见特异性着色. 与正常对照组相比, 回转组12, 24及36 h的PCNA抗体阳性细胞的比率无明显差异; 48, 72 h回转组PCNA抗体阳性细胞比率明显减少(P<0.05及P<0.01, 表1).12, 24, 36 h回转组的G0+G1期、S期和G2+M期细胞比例与对照组相比无明显差异, 48, 72 h回转组G0+G1期细胞比例较对照组明显增多(P<0.01及P<0.05, 表1), 单独比较48, 72 h组的S期及G2+M期细胞比例, 无统计学差异, 但S期与G2+M期细胞之和较对照组显著减少(P<0.01及P<0.05, 表1).

表1 模拟失重作用下SGC-7901细胞的PCNA表达和细胞周期(mean±SD, %, n = 6).
分组12 h24 h36 h48 h72 h
对照PCNA92.0±1.0993.2±2.7097.0±0.9393.2±1.1395.1±1.95
G0+G146.8±3.7657.2±4.3363.7±1.8255.8±2.2957.5±3.49
G2+M13.0±5.8519.1±5.473.7±1.613.1±1.074.1±2.21
S40.1±2.9523.8±2.6732.6±2.0441.2±2.8938.6±4.87
G2+M+S53.2±3.7642.8±4.3336.3±1.8244.2±2.2942.7±3.44
回转PCNA90.4±2.7594.1±1.3291.9±2.3287.1±2.17a86.0±1.56b
G0+G144.1±5.0463.2±3.9867.7±4.2371.0±3.92b67.0±1.98a
G2+M11.4±5.329.4±3.074.7±1.5311.3±6.405.7±1.89
S44.5±3.8027.4±2.5527.8±5.5317.9±5.9827.2±2.98
G2+M+S56.0±5.0436.8±3.9532.5±4.2629.2±3.9733.0±1.98
aP<0.05,
bP<0.01vs对照组.
图1
图1 12 h SGC-7901细胞PCNA抗体的表达SABC×400. A: 回转组; B: 对照组.
图2
图2 24 h SGC-7901细胞PCNA抗体的表达SABC×400. A: 回转组; B: 对照组.
图3
图3 36 h SGC-7901细胞PCNA抗体的表达SABC×400. A: 回转组; B: 对照组.
图4
图4 48 h SGC-7901细胞PCNA抗体的表达SABC×400. A: 回转组; B: 对照组.
图5
图5 72 h SGC-7901细胞PCNA抗体的表达SABC×400. A: 回转组; B: 对照组.
3 讨论

PCNA的表达与细胞周期有关, 能反映全部细胞的增生情况, 故常将PCNA作为衡量组织内细胞增生水平的客观指标之一[4]. PCNA的表达能够较好地反映胃腺癌的浸润、转移能力[5-6]. 我们以细胞中PCNA抗体的表达研究细胞增生的变化, 并用流式细胞仪测试SGC-7901细胞的细胞周期的变化. 因为在太空中做试验受到许多条件的限制, 有一种地面模拟失重的方法是利用回转器[7], 达到模拟微重力的效果, 常用于单细胞生物实验[8]. 本实验显示在回转器模拟失重条件下胃癌细胞的增生受到抑制, G0+G1期细胞的比例增加, 推测在模拟失重状态下, 胃癌细胞细胞周期的正常转化受到一定的影响, 使一部分细胞停滞在G0、G1期, 延迟了向S期的转化, 并进一步导致细胞延迟进入G2+M期. 这与以往关于失重或模拟失重状态下肿瘤细胞增生和周期变化的研究基本一致, 在回转器模拟失重状态下, 人大肠癌细胞MIP-101较对照增生比率降低, 而凋亡比率增高[9]; 人前列腺癌细胞DU-145生长慢、增生少、分化好[10]; 一种转染Sp2/0骨髓瘤细胞系P3A2的生长显著减少[11]; 模拟失重可导致人甲状腺滤泡癌细胞ML-1进入早期细胞程序死亡[12-14]. 人乳腺癌细胞MCF-7放入太空舱内飞行后, 细胞增生也减少了[15]. 但是在回转器模拟失重状态下, 人胰腺癌NOR-P1细胞较对照组出现较多的有丝分裂细胞(Ki-67阳性细胞)和较少的凋亡细胞[16].

失重对正常细胞的增生和周期的影响也基本是抑制的: 在回转器模拟失重后, 人骨髓CD34+细胞细胞分化、移行的潜力和细胞周期的进行都可被显著抑制[17-18]; 成骨细胞增生受到抑制[19], G1期细胞显著增多, 而S期细胞则显著减少, G2+M期的细胞也明显少于对照组[20]; 其数量减少或凋亡增多[21-22]; C6神经胶质细胞回转器模拟失重30 min后出现典型的凋亡改变, 但是20或32 h后凋亡的细胞减少[23-25]; 人血管内皮细胞细胞增生的活力明显下降[26]. 但是, 回转器中红细胞倍增的时间仅是1 g对照组的一半, 细胞凋亡则没有区别[27]. 综上所述, 失重对大多数细胞的增生是抑制的, 并可发生细胞周期的阻滞. 与之相关的因素有: 细胞凋亡增加、线粒体和微管的破坏和重分布[14], 信号转导系统发生变化[10], 另外, 调控细胞增生的基因发生改变, 如: 抑癌基因p53增加[28], 大鼠骨骼肌细胞和成骨细胞的增生的基因被抑制[29-30]. 我们希望发现模拟失重对胃癌细胞细胞增生和周期的影响, 并在这种新的模型下对其生物学行为的变化进行研究, 进而更深入地了解肿瘤细胞的生存、生长规律.

编辑: 张海宁 电编: 潘伯荣

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