血小板活化因子受体的研究进展

摘要

血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)是目前发现的作用最强的脂质递质, 广泛存在各种组织, 并通过与其受体结合产生生物学效应. 本文就血小板活化因子受体(platelet activating factor receptor, PAF-R)理化特征、信号传导机制及其拮抗剂的新进展进行了总结与概括, 并对其发展进行了展望.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 25, 2004
Revised: November 2, 2004
Accepted: November 12, 2004
Published online: February 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)是由磷脂酶A2和乙酰基转移酶共同作用于细胞膜甘油磷酸胆碱而生成的一种生物活性磷脂, 是一种具有多种生物学活性的内源性磷脂递质, 其化学名称为１-０-烷基-２-乙酰基-sn-甘油-３-磷酸胆碱, 他是目前发现的作用最强的脂质递质, 广泛存在各种组织. PAF主要由中性粒细胞、血小板、肥大细胞、内皮细胞和巨噬细胞等产生, 在体内具有广泛的生物活性, 可刺激粒细胞聚集、趋化、产生氧自由基; 能抑制淋巴细胞再生, 降低IL-2产生; 同时能刺激B淋巴细胞产生Ig G 和Ig E; 在炎症和应激反应中能诱导肝脏合成急性时相蛋白, 诱导巨噬细胞产生IL-1、IL-6和TNF. PAF还作为创伤、休克等多种疾病的重要因子, 与疾病的发生和转归密切相关. PAF的这些生物学效应是通过与其受体结合产生的. 目前国内外许多学者就血小板活化因子受体(platelet activating factor receptor, PAF-R)进行了大量的研究, 本文就其理化特征、基因研究、信号传导机制及其拮抗剂作一综述.

1 PAF-R的理化特征

1.1 PAF受体的组织细胞分布

PAF受体是在[3H]-PAF和PAF受体拮抗剂[3H]-WEB2086的配体结合试验中发现的[1-2], 而且证实PAF受体存在于人与动物的许多细胞上, 如血小板、中性粒细胞、白血病分化细胞、Ｔ或Ｂ淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、枯否细胞和平滑肌细胞等.

1.2 PAF受体结构

人体多种细胞PAF受体的cDNA已经被克隆出来[3-7], 他们的基因编码相同, 位于第一对染色体上, 是一个具有342个氨基酸的蛋白质, 其分子质量为39 000 Ku, 是G偶联蛋白超家族中的一员, 其结构有着共同特点: 由胞外区、跨膜区、胞质结构区组成, 跨膜区是由与其他受体相似的7个疏水段组成, 但其中第二个疏水段的几个氨基酸高度保守. 豚鼠肺组织的PAF受体与视紫红质类G蛋白偶联受体有广泛的同源性, 现确定PAF受体属于G_q/11和G_i/o的G蛋白偶联受体家族[8]. PAF受体结构第三个细胞内袢环和羧基尾巴是与G蛋白相结合的部位. 在受体羧基末端具有九个潜在的磷酸化位点, 这些磷酸化位点可能调节着受体与G蛋白相结合并且可能与PAF受体迅速脱敏有关系[9]. Godfroid et al[10]对PAF受体进行了广泛研究, 认为存在下列构效关系: (1)在化学结构上1位上的疏水基团对产生激动作用是最主要的, C₁₆-C₁₈位基团可有效的引起血小板激活、低血压及血小板减少症, 而C₁₄基团可使支气管收缩; (2)2位上所连接的酯并不重要, 而在此位上的取代基的长度是关键; (3)3位上的磷酰基团很重要, 他的最佳长度是从氨基端开始n = 3. (4)甘油基的空间螺旋特征及长度很重要, 而与取代基的空间排列无关. PAF受体分子的疏水部分与细胞膜表面结合, 脂肪链插入膜内, 从而导致膜流动性的改变.

1.3 PAF受体数目

各种细胞表面的PAF受体及结合力均有很大差异如每个肝脏枯否细胞约有11 000个PAF受体, Kd值为0.45 nM(解离平衡常数Kd是受体亲和力的定量指标, Kd值越大则亲和力越小, 受体的Kd值一般在10-12-10-8 mol/L, nM为nmol/L), 而每个HL-60细胞则只有5 200个, Kd值为0.7 nM. Nguer et al[11]发现, 不同Ｂ淋巴细胞表面PAF受体数目相差很大, 发现同一细胞株(Raji细胞)培养时间不同其PAF受体数目亦不同. 这提示PAF受体的表达与B淋巴细胞激活和分化程度有关. 同样, T淋巴细胞在受到OKT3刺激后, 其PAF受体数目显著增多, 说明T淋巴细胞活化过程中亦可能有PAF受体参与. 对于正常T淋巴细胞所检测到的PAF受体数目较少, 如OKT3刺激Ｔ淋巴细胞使PAF受体数增多, 但不同时间数目相差很大. 这说明Ｔ淋巴细胞活化过程中可能有PAF受体参与其细胞代谢. 内毒素、多种细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-5)、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子、INFa, 甚至PAF本身均可上调PAF受体表达. PKC可降低其表达. Carmody et al[12]用PKC激动剂-PMA与大鼠枯否细胞共同培养已证实了该结论. 还有人报道, 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可以通过NF-κB下调PAF的表达[13].

1.4 PAF受体的亚型根据

PAF与不同细胞受体结合可发挥不同生物学效应, 以及PAF受体拮抗剂对不同细胞的功能抑制力和结合力不同, Lambrecht[14] Hwang[15]提出PAF受体亚型学说. 即PAF通过与不同亚型的PAF受体结合以发挥不同的生物学效应, 如PAF诱导的Eos超氧阴离子和过氧化物酶的释放, 就是由不同PAF受体亚型所介导的; Omingo et al[16]发现在沙鼠脑组织存在两类PAF特异性结合位点, 其也具有专一性、可逆性和可饱和性, 且这特异性结合可被其受体拮抗剂所阻断. 在人血小板上存在两类明显不同的PAF结合位点. 一类是对PAF显示出高亲和力, Kd 3713 nmol/L表现出低活性; 另一类表现出很强的亲和能力, 对PAF亲和力差. 家兔的血小板与人类相仿, 对PAF高亲和位点的Kd为0.90.5 nmol/L[17-19]. 近年来, 随着对PAF-R基因研究的深入, 人们发现了人类PAF受体基因的突变[18]. 这也在基因方面为PAF受体亚型学说提供了依据. 虽然如此, 但是现在认为一个亚型PAF受体介导所有PAF的生物学效应[21-22].

2 PAF受体的基因研究

2.1 PAF受体基因的发现与定位

1991年Honda et al[23]建立了豚鼠肺PAF受体的cDNA克隆, 并成功的进行了表达. 以后相继有人从外周血白细胞[3]、心肌细胞[6]、Eol-１细胞[7]构建了PAF受体的cDNA文库及染色体组, 获得了人PAF受体的cDNA[24]. 又有人从U-937幼单核细胞[4]、HL-60细胞[5] 获得了人PAF受体的cDNA. 人多种细胞组织中PAF受体的cDNA编码序列相同. 目前人、大鼠、小鼠的PAF受体cDNA文库都已经建立, 恒河猴PAF受体部分基因已经清楚. 人们通过cDNA编码PAF受体蛋白, 两种不同的51-非编码区被发现. 研究人类基因库表明人类PAF受体基因产生两种不同的mRNA(transcrits1和2), 他们的表达是由不同的启动子来启动的. 通过原位荧光杂交技术将PAF受体基因精确定位于1号染色体1p35至p34.3. 小鼠的PAF受体基因也通过原位荧光杂交技术将其定位在第四号染色体D2.2段[25]. 猪的PAF受体定位在SSC6q26-27[23].

2.2 PAF受体基因多态性

在探索PAF受体基因多态性时, 人们发现了他的新变化: 在其编码的氨基酸序列上的第224个氨基酸(丙氨酸)由天冬氨酸代替, 这个位置是位于PAF受体第三个细胞外环. 根据调查, 这种基因突变发生在7.8%的日本人口中[20]. 为了研究此种突变基因的特点, 研究人员使中国仓鼠卵巢细胞转染并表达突变基因型受体或野生型受体. 通过比较两种受体的信号转导变化, 研究人员发现突变型受体明显对PAF的反应降低, 说明突变受体对Gi和Gq蛋白结合力降低[20].

2.3 通过转基因小鼠对PAF受体的研究

近年来, 为了更好的研究PAF和PAF受体生理、病理特点, 人们通过应用转基因技术培育了PAF受体过度表达的PAFR-Tg小鼠[23]和PAF受体缺失的PAFR-KO小鼠[26]. 前者在心脏、骨骼肌中PAF受体处于高水平, 在眼、皮肤、气管和大动脉中处于中度水平, 但是在嗜中性粒细胞、脑、肺、肝、脾、小肠、子宫和睾丸表达很少. 这可能是因为在胚胎期广泛过度表达PAF受体对胚胎有致死作用, 而现在的表达谱类型则是自然选择的结果[26]. 后者通过Southern和Northern分析方法证实其嗜中性粒细胞未表达出具有活性的PAF受体, 腹膜巨噬细胞和肺组织也没发现PAF拮抗剂WEB2086的结合位点[25]. PAFR-KO小鼠体内激活的PAF不再诱使中性粒细胞内钙离子浓度升高也不使平均动脉压下降. 这说明PAF受体是PAF 诱导胞内钙动员的必需因子[27]. 转基因小鼠可以方便PAF受体的研究. 例如: 转基因小鼠来探索小鼠低氧血症时PAF受体对呼吸机制的调节. 他们发现在间断缺氧14 d后, PAFR(-/-)小鼠的通气量与PAFR(+/+)小鼠相比有明显的下降. 后者表现出突出的通气时间延长. 可以推论出PAF受体表达和功能是间断缺氧情况下诱导长时程通气的关键因素[28].

3 PAF受体的信号转导机制

PAF与受体结合后的细胞内信号转导可能有以下途经[29-34]: (1)通过G蛋白转导激活磷脂酶C(PLC_b), 第二信使为二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(PI3), 前者激活蛋白激酶C(PKC), 再激活转录因子NF-κB等, 后者诱导细胞内Ca²⁺浓度升高; (2) 通过G蛋白转导活化腺苷环化酶(AC), 第二信使cAMP激活蛋白激酶A(PKA); (3)通过直接或间接方式激活酪氨酸蛋白激酶(PTK), 再活化磷脂酶D(PLD)、PLCg、磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK), 前三者第二信使也为DAG和IP₃, 而MAPK属于一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. 近来研究表明丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径调节两个关键酶: PLA₂和乙酰转移酶, 这两种酶与PAF的再修饰途径有关[33]. PAF的合成有两条酶促途径[34]: (1)在磷脂酶Ａ2(PAL2)和乙酰辅酶Ａ作用下生成PAF, 称再修饰(remodeling)途径, 这是一种可逆性的病理过程; (2)从烷基甘油磷酸开始, 经乙酰转移酶、磷酸胆碱转移酶等作用, 最终合成ＰＡＦ, 称为新生(denovo)途径, 为存在于体内的正常合成途径, 这条途径是生理条件下产生PAF的主要途径. 修饰途径是病理条件下合成PAF的主要途径: 肝病时, 在激动剂的刺激下, 肝Kupffer细胞及肝内皮细胞会通过此途径合成大量PAF; 修饰途径的前体底物为Sn₂位上带有长链脂肪酰基的磷脂甘油胆碱, 他在磷脂酶A₂(PLA₂)的作用下, 其Sn₂位上酯键断裂或脱酰基, 生成无活性的LysoPAF和长链不饱和脂肪酸, 前者的Sn₂位在乙酰转移酶的作用下被乙酰化生成PAF, 后者经环氧酶和脂氧酶的作用生成AA、前列腺素(PG)及血栓素Ｂ2(TXB2)等, 此过程可逆且伴有大量花生四烯酸生成. 而新生途径则是生理条件下合成PAF的主要途径, 他的合成前体底物为烷基甘油磷酯, 此过程不可逆, 亦不伴AA的产生; 脑肾等组织利用此途径合成PAF, 调节人体血压, 维持自身器官稳定. 对于磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K), 最新研究证明在胚胎的早期PAF起着关键的调控作用, 他通过与其受体结合作用于磷脂酰肌醇途径来提高胚胎的生存率[37]. (4)同时也激活G蛋白受体激酶(GRK), 可以及时关闭信号传导; (5)不同信号途径可能存在交叉对话. 以上蛋白激酶激活后可引起相应靶蛋白磷酸化和/或激活靶基因转录, 从而发挥生物学效应. 但是到目前为止尚无相关文献对这些信号转导途径有明确的报道.

4 PAF受体的抑制剂和拮抗剂

4.1 抑制剂

凡能抑制PAF合成及促进其降解的药物, 均可影响其生物学效应的发挥, 此类物质为抑制剂, 按其作用机制可分为以下四类: (1)Ｃa²⁺螯合剂EDTA, 钙通道抑制剂异搏定, 钙调素抑制剂三氟拉嗪, 他们通过抑制具有钙依赖性的PAF合成酶PLA₂, 而抑制PAF的合成; (2)具有调节环核苷酸(cAMP)水平的药物, 如调节cAMP的PGI₂、PGE₂、b₂肾上腺素物质, 调节cGMP磷酸双脂酶抑制剂, 从而发挥间接作用; (3)PLA₂活性抑制物如可的松、强的松龙、柳氮磺胺吡啶、5-对氨水杨酸均能抑制由Ca²⁺载体Ａ23187所致的PAF合成; (4)其他: 色苷酸盐, 促甲状腺释放激素、纳洛酮、Tidopidine、阿托品、异丙嗪的某些衍生物、Ｃ反应蛋白和TXA2拮抗剂也具有对抗PAF的作用, 能阻断PAF诱发的支气管收缩和血小板分泌.

4.2 PAF受体拮抗剂

他是能与PAF竞争受体, 从而阻止PAF生物学效应的物质. 目前已知的PAF拮抗剂分为三大类: (1)PAＦ结构类似物, 这是以PAF为模型设计的一系列甘油衍生物, 主要有(1)CV3988、CV5898、CV6290; (2)NO6240; (3)SRI62-436、SIR62-586、SRI63-072、SIR63-073、SR163-119、SRI63-441; 其中(1)为天然骨架; (2)为非天然骨架, 是乙酰转移酶抑制剂, 是将PAF环接而成, 具中度拮抗PAF作用. (2)天然药物. 是一些从自然界存在的物质中分离提纯的物质. 包括: (1)来自中国银杏树中分离出的萜烯类化合物, 如银杏苦内脂Ａ、Ｂ、Ｃ, 银杏苦内脂Ｂ又称BN52021, 中国海风滕中提取的海风滕酮, 从川芎中提取的川芎嗪; (2)木脂素和新木质素; 支霉粘素和相关产物, 是从真菌(Ｓ, phcafaciens)和微生物发酵中分离出, 具有双烷硫呱嗪骨架, 其中活性最强的为FR900452和FR49175.(1)和(2)类可与PLA₂分子上赖氨酸残基不可逆结合而抑制PAF合成. (3)人工合成化合物, 主要有WEB2086、WEB2170、ORP4874、STY2108. 其中STY2108作用最强. 目前应用最广泛的有CV3988、BN52021、WEB2170、WEB2086. 应用放射性配体结合实验、RT-PCR、Western-blot分析方法发现结合在细胞膜上的[³H]-PAF可以被[³H]-PAF、三磷酸鸟嘌呤的非水解类似物(Gpp[NH]p)、溶解性PAF所替代. 在PAF受体的拮抗剂中, 14-去氧穿心莲内酯和WEB2086对[³H]-PAF抑制性结合位点结合性最强. 木脂素类的两种物质: 五味子内酯甲和谷维素-五味子素对[³H]-PAF抑制性结合位点也有影响. 但是银杏内脂(BN52020和BN52021)抑制[3H]-PAF的能力仅为中等水平[38].

4.3 受体拮抗剂与疾病

新生儿坏死性小肠炎目前是世界新生儿专家所面临的问题. 在新生低体重儿, 此病的发病率达到28%.目前, 有效的预防措施为PAF受体拮抗剂和生物制剂的应用[39]. Nawal et al[40]研究表明, HIV(人类免疫缺陷病毒)感染与炎症反应综合征和神经病学功能失调有关. AIDS的病理生理学的组织损伤与HIV感染和/或活化的巨噬细胞释放的各种前炎症细胞因子TNF-α和脂质递质PAF有关. 在脑脊液中PAF水平升高, 改变了脑的免疫系统从而导致神经系统的受损. TNF-α和PAF被认为有神经毒性, 但PAF水解酶和拮抗剂均可降低PAF和TNF-α的水平, 在临床上表现为HIV相关的症状减轻. 这是因为PAF能上调TNF-α的合成, 而TNF-α可上调HIV在脑组织中的复制, 故PAF拮抗剂可减轻HIV感染的神经病学表现起重要作用.

5 展望

通过对动物、人及转基因动物PAF受体的进一步研究, 充分认识到PAF和PAF受体可引起多种疾病如支气管炎、低血压、血管通透性升高、内毒素休克等. 利用生物技术以及新方法, PAF和PAF受体的致病机制越来越多的被了解. 在充分认识PAF受体介导的细胞内信号转导机制的基础上, 对PAF受体拮抗剂需进一步研究. 通过阻断PAF受体的始动作用以阻止各类疾病的发生发展, 对目前一些疑难疾病如SIRS、MODS、AIDS等防治有重要意义. 针对PAF和PAF受体新的系统治疗方法也将出现.

备注

编辑:张海宁

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