CD4+CD45RBhigh T细胞转入 SCID 鼠诱导的结肠炎模型

摘要

炎症性肠病的病因未明, 因此此疾病的动物模型的制备比较困难. 现有的多种制模方法都不能完全模拟人的炎症性肠病. 我们介绍一种比较新的免疫方法诱导的结肠炎动物模型, 即用CD4⁺CD45RB^high T细胞转入SCID鼠诱导产生结肠炎. 以下就此模型的制备方法、原理、特点、与IBD的相似处、用途、优缺点作一综述.

关键词: β-catenin; Wnt信号通路; 消化道肿瘤

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 12, 2005
Revised: December 20, 2005
Accepted: December 24, 2005
Published online: December 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

炎症性肠病 (IBD) 是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病, 包括克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC). 它的病因未明, 发病有免疫、遗传、环境、微生物等因素参与. 由于IBD的发病机制复杂, 所以很难建立理想的动物模型. 我们介绍一种较新的免疫方法诱导的结肠炎动物模型, 即用CD4⁺CD45RB^high T细胞转入SCID鼠诱导产生结肠炎. SCID鼠全称为严重联合免疫缺陷鼠, 1983年由Bosma et al培育成功, 是一种淋巴细胞分化过程严重受损的突变小鼠, 因其抗原受体基因重组异常, T、B淋巴细胞不能发育成熟, 机体的体液和细胞免疫功能均缺陷[1]. 在SCID鼠中转入CD4⁺CD45RB^high T细胞后由肠内细菌导致Th1型免疫反应介导的结肠炎.

1 建立方法

1.1 结肠炎的诱导

实验者用抗CD4的磁性活化细胞分离系统从正常BALB/c鼠的脾中分离出CD4+T细胞. 纯化的CD4⁺T细胞用接合藻红蛋白 (PE) 的抗小鼠CD4和接合异硫氰酸荧光素 (FITC) 的抗小鼠CD45RB单克隆抗体标记, 在流式细胞仪上分类为CD4⁺CD45RB^high T细胞和CD4⁺CD45RBlowT细胞[2]. CD4+CD45RBhigh T细胞是CD4⁺T细胞群中染色最亮的, 占40-50％, 其分离后纯度至少达到98％. 然后每只BALB/cSCID鼠腹腔内注射200 μL磷酸盐缓冲溶液, 其中含有5×10⁵ CD4⁺CD45RB^highT细胞[3,4]. 其它报道的腹腔内注射剂量可为1-10×10⁵的CD45RBhighCD4⁺T细胞.

1.2 临床表现

SCID鼠转入CD4⁺CD45RB^high T细胞后3-5 wk小鼠体质量缓慢减轻[5], 到30 d时平均减轻25％[6]. 鼠出现竖毛、拱背, 有软便甚至腹泻. 部分实验者提及鼠有血便[7]、直肠脱垂[8]. 一些研究选择在7 wk时给予临床评分, 为以下3个参数的总和: 0或1, 拱背和体质量减轻; 结肠增厚0－3(0: 无结肠增厚; 1: 轻度增厚; 2: 中度增厚; 3: 重度增厚); 粪便黏度0-3(0: 正常粪便; 1: 软便; 2: 腹泻; 3: 肉眼血便)[9].

1.3 大体形态

此模型中病变广泛分布于直肠至盲肠, 结肠炎的发病率和严重度通常在直肠至横结肠最重, 盲肠相对最轻. 鼠的结肠肠壁增厚, 肠管缩短, 其炎症一般位于黏膜, 严重者为透壁性炎症[3].

1.4 组织病理

结肠炎鼠有肠炎性改变和上皮病变. 炎性病变包括炎性细胞浸润、隐窝脓肿、肉芽肿性炎症. 炎性浸润包括巨噬细胞、淋巴细胞浸润, 伴少量中性粒细胞、嗜酸性细胞. 病变最初固有膜少量炎性细胞浸润, 炎症加重后可见到隐窝脓肿. 炎症偶尔在小病灶区形成肉芽肿, 特征是上皮巨噬细胞聚集伴少量淋巴细胞、中性粒细胞.

此模型最主要的上皮病变是增生, 可表现为上皮腺体层增厚、腺体扭曲、隐窝延长, 另外有溃疡、黏蛋白缺失、隐窝缺失. 溃疡处有大量中性粒细胞, 溃疡底部大量炎性细胞浸润及组织中度纤维化. 其他大肠病变包括腔内上皮脱落、黏膜下水肿、淋巴管扩张.

透壁性炎症是CD的特征. 透壁性炎症最多见于横结肠, 经常伴有溃疡. 透壁性炎症为跳跃性分布, 未累及整个肠道.

炎性病变也见于其他消化道组织. 炎性病变最容易累及胃, 淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润于胃黏膜肌层, 十二指肠炎偶可见到. 虽然盲肠病变多见, 但是回肠中未发现病变, 食管炎罕见. 在消化道外的炎性病变主要在肝, 肝中少量的外周淋巴细胞、中性粒细胞浸润. 其他病变有脾大[10]、骨质稀少[11]、肺炎及甲状腺炎.

1.5 免疫病理

此模型鼠结肠的免疫组化显示固有膜中大量的巨噬细胞、中等数量的CD4+淋巴细胞浸润. 流式细胞分析证实结肠炎鼠固有膜中CD4⁺淋巴细胞数量是正常BALB/c鼠中的三倍, 且多为活化的表型. 免疫荧光显示炎性大肠上皮中主要组织相容性复合体Ⅱ蛋白 (MHCⅡ) 增加[3].

2 原理

对于此模型原理的探讨将有助于理解IBD的病因、发病机制. 首先, 此模型为CD4+CD45RBhigh T细胞转入SCID鼠. 此鼠的T、B淋巴细胞不能发育成熟, 机体的免疫功能严重缺陷. 在SCID鼠转入CD4⁺CD45RB^high T细胞后导致结肠炎, 而CD4⁺CD45RBlowT细胞亚群转入未引起结肠炎. CD4⁺CD45RBlowT细胞亚群与CD4⁺CD45RB^high T细胞共转入可阻止结肠炎的发病[12]. 以上结果表明正常鼠中存在功能特异的调节性T细胞亚群[13], 它可阻止结肠炎的发病, 因此正常鼠不发病.

其次, 结肠炎鼠发病并非外源性病原体感染所致. Leach et al[3]将鼠处死并进行尸检, 取鼻咽、盲肠、腹膜、肝部位进行培养; 对盲肠内容物和肛门周围区域行寄生虫学检查; 行常规血清病毒和细菌检查; 对多个器官采取多种染色方法进行染色以寻找病原体. 结果证实这些鼠中无明显的病原体. 这与现有的关于IBD的发病机制研究始终未找到特异的病原体相一致.

再次, 肠道菌丛参与此模型的发病. Morrissey et al[14]在此模型鼠饮用水中加入抗生素, 之后的4 wk内鼠体质量一直增加, 撤药后鼠体质量迅速减轻. 以上提示肠内的肠道菌丛可刺激CD4+CD45RBhigh T细胞扩增. 此模型中与肠道菌丛相关的免疫调节紊乱导致结肠炎. 这与IBD患者中肠道菌丛紊乱, 用抗菌素和促生素治疗可取得疗效相符合[15].

最后, 关于此模型的免疫学机制, 结肠炎的发病需要免疫缺陷宿主中MHC II分子的表达. Matsuda et al[16]分析患病鼠大肠细胞的T细胞抗原受体(TCR)β所有组成成分, 发现特异的TCR群. 核苷酸序列分析显示它有特异的CDR3β氨基酸序列. 这些提示肠T细胞扩增和结肠炎的发病都需要活化抗原特异的T细胞. 把不同个体的TCRβ所有组成成分比较时, 几乎没有重叠, 这提示有多种抗原可刺激T细胞扩增, 在肠道产生T细胞群. 我们知道健康人的结肠黏膜中MHC II分子没有表达, 而IBD患者的结肠黏膜上皮中MHC II抗原表达. 免疫异常为IBD的发病机制中重要的一点.

3 特点

此模型中有结肠T细胞扩增、Th1型免疫反应参与、黏附分子增加, 而且特定的细胞群可调节此模型中的结肠炎.

第一, 他是Th1型免疫反应介导的结肠炎[17]. Th1型细胞产生的细胞因子表达增加, 如INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-18[18]. 用抗IFNγ或抗TNF-α单克隆抗体治疗都可以预防结肠炎. IL-6基因缺乏的鼠来源CD4+CD45RBhigh T细胞转入SCID鼠, 可使结肠炎减轻、透壁性炎症减少、促炎症因子表达减少[19]. 用人类重组IL-10治疗可完全预防结肠炎[20]. Leach et al研究此模型中IL-10的作用, 并证实IL-10作为免疫调节因子可控制Th1型的免疫反应[21].

第二, 此模型中黏附分子表达增加. 几种内皮黏附分子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) 和黏膜定居细胞黏附分子1(MAdCAM-1) 在CD4⁺CD45RB^high T细胞转入的SCID鼠结肠血管中显著增高. 模型组鼠6-8 wk时, 炎性结肠中ICAM-1和VCAM-1为正常组的3倍, MAdCAM-1为正常组的9倍[^18]. Shigematsu et al[22]等用活体的荧光显微镜进行定量观察, 发现淋巴细胞/内皮细胞黏附分子大量存在于SCID鼠的静脉和黏膜中. 用抗MAdCAM-1的单克隆抗体可明显减少结肠炎鼠的淋巴细胞/内皮细胞黏附分子[23]. 免疫染色也显示表达MAdCAM-1的T细胞位于结肠内皮细胞. 以上表明MAdCAM-1与炎性结肠中T细胞的聚集明显相关. 此模型中淋巴黏附分子局灶性分布. 淋巴黏附分子的数值和临床表现相关. 这提示此结肠炎的发病高度依赖于淋巴细胞, 淋巴细胞相关的干预可减少炎性反应和减弱黏膜损伤.

第三, 他可被特定的细胞群调节. CD4⁺CD45RBlowT细胞亚群与CD4⁺CD45RB^high T细胞亚群共转入可阻止结肠炎的发病. 对CD4⁺CD45RBlowT细胞转入的免疫抑制机制的分析显示IL-10和TGF-β起到了必要的作用[12]. 进一步的实验显示CD4⁺CD25⁺ T细胞能够治疗此模型的肠炎症. 结肠炎鼠中转入CD4⁺CD25⁺ CD45RBlowT细胞, 可使肠固有膜炎性浸润减少, 肠结构恢复正常[24]. 鼠CD4⁺CD25⁺T细胞活化后细胞表面表达潜在相关肽 (LAP) 和TGF-β, 在体外通过膜联合的TGF-β发挥调节功能. CD4⁺CD25－LAP－T细胞是CD45RBlow细胞群的一部分, 它在此模型中也有调节结肠炎的作用[25].

4 此模型与IBD的关联性

这些鼠大肠的形态特征和IBD患者中所见相似. CD的大体形态特征是病变呈节段性, 可为透壁性, 组织学特征包括淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞浸润, 裂隙状溃疡, 淋巴结聚集. UC病变连续性分布、直肠累及最多, 主要位于大肠黏膜和黏膜下层, 淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润, 黏蛋白缺失, 隐窝脓肿. 结肠炎鼠病变的分布与UC相似, 隐窝延长、广泛的黏蛋白缺失都为UC相关的特征. 相反, 鼠的透壁性炎症更多见于CD. 因此, 这些鼠的大肠病变并不完全模拟CD或UC中的某一个.

关于免疫病理: (1) T细胞介导的免疫反应在IBD的疾病过程中起主要作用. CD被认为是Th1型免疫反应引起. 此模型以Th1型免疫反应为主, 因此更近似CD[2]. (2) IBD患者中巨噬细胞增加. (3) IBD患者中MHCⅡ表达增加. 此结肠炎鼠大肠中活化的CD4⁺ T细胞、大量的巨噬细胞、增加的上皮MHCⅡ表达, 这些都与IBD患者相似.

另外, 此结肠炎鼠中黏附分子表达增加也与IBD患者一致. 黏附分子能介导细胞黏附、趋化、淋巴细胞归巢等. UC患者中ICAM-1 和VCAM-1蛋白和mRNA表达比正常对照组均显著增高, 糖皮质激素和柳氮磺胺吡啶(SASP) 治疗可使其降低[26].

5 用途

此模型可用于研究IBD的病因和发病机制, 探讨疾病发展规律, 研制新药. 他作为新颖的实验方法, 特别适用于IBD的免疫学研究. 以下就多组相关实验做简要介绍.

IBD患者炎性黏膜中CD40和CD40配体 (CD40L) 表达增加. 活化的T细胞表达CD40配体, 抗原递呈细胞(APC) 表达CD40. 它们的交互作用对体液免疫、细胞免疫起到了关键作用. CD40信号通路刺激B细胞活化、增殖, 免疫球蛋白类别转换, 刺激单核巨噬细胞活化等. 此模型鼠炎性黏膜中CD40和CD40配体的mRNA水平显著增高. 转入CD4+CD45RBhigh T细胞后立即给予抗CD40L单克隆抗体, 肠炎得到有效预防. 转入CD4+CD45RBhigh T细胞后5-8 wk给予抗CD40L治疗, 结肠炎临床症状和组织病变显著改善. 此模型中Th1型炎性反应的产生必须有CD40-CD40L的交互作用. 这个实验证实阻断CD40信号转导对IBD患者有益[27].

除了CD40和CD40配体, IBD中共刺激分子包括程序性死亡因子-1(PD-1)(其配体为B7-H1和B7-DC)、OX40(又名CD134)、CD2、诱导的共刺激分子 (ICOS) 等. 抗B7-H1单克隆抗体可抑制结肠炎[9]. 抗OX40配体单克隆抗体对预防和治疗结肠炎都有效[28]. αCD2单克隆抗体能够延迟转入CD4⁺CD45RBhighT细胞的结肠炎的发病和改善已有的结肠炎的临床和组织病变[7]. 抗ICOS单克隆抗体可通过诱导表达ICOS的T淋巴细胞凋亡来预防和逆转肠炎[2].

此结肠炎模型中应用重组人角质化细胞生长因子[6]、μ阿片受体 (MOR) [29]、饮食的n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs) [30]治疗有效. 淋巴细胞毒素 (LT)α/β是肿瘤坏死因子 (TNF) 家族的一员. 可溶性的LTβ受体免疫球蛋白治疗可改善结肠炎的临床症状和减轻其组织病变[31].

6 优缺点

该方法的优点是造出的模型具有自发性的特点, 能很好的模拟人类疾病, 对于所要观察的指标有很好的针对性, 为揭示发病原因和提供新的治疗手段开辟了广阔的前景. 缺点是实验周期长、技术要求高、对于实验条件限制较大、代价也比较高. 同时我们必须客观地认识到它与其他众多的模型一样无法解决结肠炎的维持、慢性化与复发的问题.

总之, 我们介绍了CD4⁺CD45RB^high T细胞转入SCID鼠诱导的结肠炎模型的制备方法、原理、特点、与IBD的相似处、用途、优缺点, 希望这个模型的介绍有助于人们深入理解IBD的病因、发病机制, 并应用此模型研究新的治疗方法. 目前, 国内尚未有成功制备此模型的报道. 我们希望本文将有益于开扩各位学者对IBD的研究思路.

备注

电编: 张勇 编辑: 菅鑫妍 审读: 张海宁

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