胃癌组织中法尼基转移酶基因表达与临床病理特点及H-ras突变的关系

摘要

目的: 检测人胃癌及相应癌旁组织中法尼基转移酶(FTase)β-亚单位mRNA表达和H-ras基因第12密码子点突变探讨FTaseβ-亚单位基因在胃癌中的表达与临床病理特点、H-ras基因突变的关系.

方法: 收集胃癌及相应癌旁正常组织标本43例. 应用半定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)测定FTase β-亚单位mRNA基因表达水平, 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析H-ras基因第12密码子点突变情况. 采用秩和检验分析胃癌和癌旁组织的FTase β亚单位mRNA 表达的配对数据的差异; 采用多元逐步回归分析胃癌组织中FTaseβ 亚单位mRNA 表达活性与临床病理特点及H-ras基因突变间的关系.

结果: 胃癌组织中FTase β亚单位mRNA的平均值明显高于癌旁组织(0.89±0.48 vs 0.69±0.40), 两者相比有显著性差异(Z = 2.469, P = 0.014). 在43例胃癌组织中有1例发现突变(1/43, 2.3%), 癌旁组织中未发现突变. 胃癌组织的FTase β亚单位mRNA 表达活性与年龄、肿瘤部位、组织学分级、有无淋巴结转移及有无H-ras基因突变无关, 在女性, 病理分型为印戒细胞癌的胃癌组织中有较高的FTase β亚单位mRNA 表达活性.

结论: FTase β亚单位mRNA在胃癌组织中表达升高. 胃癌组织中H-ras基因第12密码子点突变率低, 在胃癌的发生中不起主要作用, 并且与FTase β亚单位mRNA 的表达无相关.

关键词: 胃癌; 法尼基转移酶; H-ras基因; 突变; 聚合酶链反应

Relations farnesyltransferase beta-subunit mRNA expression with clinicopathological features and H-ras mutation in gastric cancer tissues

Hua-Li Gu, Zi-Bin Tian, Qi-Xin Wang

Hua-Li Gu, Qi-Xin Wang, Department of Emergency for Internal Medicine, the Affiliated Hospital of Medical College of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Zi-Bin Tian, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Medical College of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Correspondence to: Dr. Hua-Li Gu, Department of Emergency for Internal Medicine, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China. qdguhuali@163.com

Received: August 3, 2005
Revised: August 15, 2005
Accepted: August 26, 2005
Published online: November 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the expression of farnesyltransferase(FTase) beta-subunit mRNA in gastric cancer tissues and its relations with the clinicopathological features and point mutation in codon 12 of H-ras gene.

METHODS: Specimens were collected from 43 cases of gastric cancer and their corresponding normal tissues. The expression of FTase beta-subunit mRNA was investigated by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The point mutation in codon 12 of H-ras gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Wilcoxon Signed-Rank Test was used to analyze the difference of the matching data of FTase beta-subunit mRNA expression between gastric cancer and normal tissues. Multiple linear regression analysis was used to explore the relations of FTase activity with the clinicopathological features and H-ras mutation in gastric cancer.

RESULTS: The mean level of FTase beta-subunit mRNA expression were significantly higher in gastric cancer tissues than that in the corresponding normal ones(0.89 ± 0.48 vs 0.69 ± 0.40, Z = 2.469, P = 0.014). Of the 43 cases, the mutation of H-ras 12 codon was found in 1 case of cancer tissue(1/43, 2.3%), and no mutation appeared in the all the normal tissues. The expression of FTase beta-subunit mRNA was not related to the age, tumor location, histological differentiation, lymph node metastasis and H-ras 12 codon mutation. But the female patients with signetring cell carcinoma had higher expression of FTase beta-subunit mRNA.

CONCLUSION: The expression of FTase beta-subunit mRNA is up-regulated in gastric cancer. The point mutation in codon 12 of H-ras gene is not related to the expression of FTase beta-subunit mRNA.

Key Words: Gastric cancer; Farnesyltransferase; H-ras gene; Mutation; Polymerase chain reaction

0 引言

法尼基转移酶(Farnesyltransferase, FTase)是一种细胞溶质中的酶, 广泛存在于哺乳动物细胞、酵母及卵蛙细胞中, 催化一些细胞多肽翻译后修饰的第一步骤(法尼基化), 底物包括: Ras蛋白, 核纤层蛋白A, B(lamin A, lamin B), 视紫红质激酶(rhodopsin kinase), 磷酰化酶激酶, cGMP磷酸二酯酶的α亚单位和转导素(transducin)的γ亚单位等.FTase是由α和β亚单位组成的异二聚体, α亚单位识别法尼基焦磷酸(FPP), β亚单位结合至Ras蛋白[1,2]. 研究表明, 约30%的人类肿瘤有ras基因突变, 并有Ras蛋白高表达[3], 突变的Ras蛋白可刺激细胞增殖和抑制凋亡从而促使肿瘤发生、发展. Ras蛋白的生物活性与法尼基化修饰有密切关系. 因此, 法尼基转移酶已成为抗癌治疗的一个重要靶标和研究热点. 法尼基转移酶抑制剂正在肺癌、头颈部癌、结肠癌和胰腺癌等实体癌中进行Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ期临床试验[4-10]. 近期的研究表明, FTase在多种肿瘤组织中活性增强, 提示FTase可能是肿瘤发生的标志物, 有望成为肿瘤诊断的一项指标[11-13]. 我们检测人胃癌和癌旁组织中法尼基转移酶β-亚单位mRNA表达水平和H-ras基因第12密码子点突变情况, 探讨法尼基转移酶β-亚单位基因在胃癌中的表达及其与临床病理特点、H-ras基因突变的关系, 了解其在胃癌诊断、判断预后的价值, 为法尼基转移酶抑制剂治疗胃癌提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

胃癌和癌旁组织标本43例来源于2000-06/2001-06青岛大学医学院附属医院行胃大部切除并经病理证实的胃癌病人. 均于术中取新鲜胃癌组织和相应癌旁组织(距离癌组织5 cm以上), 放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理且高压灭菌的15 mL离心管中, -70℃冻存备用. 男35例, 女8例, 年龄31-81(56.9±14.0)岁. 病变部位: 胃窦部23例, 胃底/体部17例, 贲门部3例. 腺癌41例, 印戒细胞癌2例. 高分化1例, 中分化9例, 低分化33例. 临床分期均为进展期. 淋巴结转移32例, 无淋巴结转移11例. UICCⅠ期11例, Ⅱ期28例, Ⅲ期14例. PCR扩增仪480型(美国PE公司); 恒压恒流电泳仪、微型水平电泳槽(Bio-Rad公司); 高速低温台式离心机3K30型(德国Hereaus公司); 紫外投射仪(美国PE公司); 影像分析系统(北京亚力恩明胶分析系统2000); Reverse Transcription System(美国Promega公司); TRIzol D-Hanks液(美国GIBCO公司); 蛋白酶K(德国Merck公司); PCR引物及反应体系, 饱和酚, 氯仿, 异戊醇, Tris, EDTA, 硼酸和琼脂糖等(上海生工生物技术服务有限公司).

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法检测FTase β亚单位mRNA的表达: TRIzol试剂提取组织总RNA, 每例取总RNA 2 μL用AMV反转录酶进行反转录, 反转录所得cDNA用作PCR反应的模板, 扩增FTase β亚单位基因和内参照基因GADPH基因. Ftase βsubunit mRNA基因引物参照文献[11]设计, 引物序列(316 bp): 5'-ATCCAGGCCACTACATACTTT-3'(正义), 5'-GGCTGATAGATTTTTGGTTTG-3'(反义); 内参照基因GADPH基因引物序列(450 bp): 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3'(正义), 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3'(反义). 94℃预变性5 min, 然后94℃ 40 s, 56℃ 40 s, 72℃ 1 min扩增35个循环, 最后72℃延伸10 min. 扩增产物5 μL于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 紫外投射仪下观察结果并拍照, 以影像分析系统测定的表达比例(Ftase β subunit/GADPH) 进行半定量分析. 大于或等于正常平均值+2 s者确定为过度表达.

1.2.2 H-ras基因聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析: 依据制造商说明提取胃癌及癌旁组织的DNA, 每例取DNA模板1 μL进行PCR扩增H-ras基因第12密码子, 引物参照文献[14]设计, 引物序列(170 bp): 5'-CAGGGCCCTCCTTGGCAGG-3'(正义), 5'-GTCGTATTCGTCCACAAAATGG-3'(反义). 94℃预变性5 min, 然后94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s 扩增35个循环, 最后72℃延伸5 min. 取PCR扩增产物5 μL于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 与PCR Marker对照, 紫外投射仪下出现170 bp条带表明扩增成功. 扩增产物用限制性内切酶HpaⅡ酶切, 酶切产物于80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳, 对照PCR Marker判断扩增产物是否被切开, 野生型可观察到66+56+48 bp三条电泳带, 突变型只能观察到122+48 bp两条电泳带.

统计学处理 应用SPSS10.0 for Windows 软件进行统计学分析. 采用Wilcoxon 秩和检验分析胃癌和癌旁组织的FTase β亚单位mRNA表达的配对数据的差异, P<0.05为有显著性. 采用多元逐步回归分析胃癌组织的FTase β亚单位mRNA 表达活性与临床病理特点各参数、H-ras基因第12密码子点突变间的关系, 前者为应变量, 后者为自变量, P<0.05为有相关关系.

2 结果

2.1 FTase β亚单位mRNA的表达

胃癌组织43例中FTase β亚单位mRNA测定的平均数为0.89±0.48, 四分位数间距为0.66-0.96; 癌旁组织中的平均数为0.69±0.40, 四分位数间距为0.56-0.89, 两者相比有显著性差异(Z = 2.469, P = 0.014, 图1). 胃癌组织中有3例过度表达, 癌旁组织中有1例过度表达, 两组过度表达比较无显著性差异(P = 0.069 8).

图1 FTase β亚单位mRNA电泳图. 316 bp: FTaseβ亚单位mRNA; 450 bp: GAPDH mRNA; 1-7: 胃癌组织标本

2.2 H-ras基因突变

43对标本H-ras基因第12密码子PCR扩增均成功, 43例胃癌组织中有1例发现突变(1/43, 2.3%), 癌旁组织中未发现突变(图2, 3). 胃癌组织FTase β亚单位mRNA表达活性增高与性别、病理分型有关, 与年龄、肿瘤部位、组织学分级及有无H-ras基因突变无关, 发生在女性、病理分型为印戒细胞癌的胃癌组织有显著升高的FTase β亚单位mRNA表达(表1).

表1 胃癌FTase β亚单位mRNA表达与临床病理特点的多元逐步回归分析.

临床病理	n	Ftaseβ亚单位mRNA	t	P
＜50岁	14	0.94±0.39	0.356	0.754
≥50岁	29	0.82±0.38
男	35	0.81±0.28	2.566	0.014
女	8	1.26±0.91
高中分化	10	1.0±0.41	0.797	0.430
低分化	33	0.86±0.51
胃窦癌	23	0.96±0.62	0.531	0.592
胃底/体癌	17	0.82±0.28
贲门癌	3	0.75±0.10
淋巴结转移			0.259	0.797
-	11	0.92±0.49
+	32	0.88±0.49
UICC			0.284	0.755
Ⅰ期	11	0.95±0.50
Ⅱ期	28	0.92±0.63
Ⅲ期	14	0.81±0.18

组间比较F值.

图2 H-ras基因第12密码子酶切产物电泳图. M: Marker; 1-8: 胃癌和癌旁组织标本, 均为野生型; 9: PCR产物.

图3 H-ras基因第12密码子酶切产物电泳图. 2-4: 部分胃癌组织标本, 均为野生型; 5: PCR产物. M: Marker; 1: 1例胃癌组织标本, 突变型.

3 讨论

FTase属于蛋白异戊二烯转移酶超家族, 是细胞增殖所必需和潜在的生长调控者[12]. 目前法尼基转移酶已成为抗癌治疗的一个重要靶标和研究热点. 因此法尼基转移酶已成为抗癌治疗的一个重要靶标和研究热点. 法尼基转移酶抑制剂在肺癌、头颈部癌、结肠癌和胰腺癌等实体癌中正在进行Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ期临床试验[4-10]. Khan et al[11]观察到与正常组织比较, 人皮肤基底细胞癌中法尼基转移酶mRNA表达增加; Nagase et al[12]发现人卵巢癌中法尼基转移酶β亚单位mRNA表达过度并与K-ras突变有关; Caruso et al[13]发现人结直肠癌中法尼基转移酶活性高于正常黏膜, 且与K-ras突变有关, 其β亚单位蛋白水平也较正常组织明显增高, 但β亚单位mRNA水平无差异. 以上研究表明, FTase在多种肿瘤组织中活性增强, 提示FTase活性可能是肿瘤发生的标志物, 有望成为肿瘤诊断的一项指标. 我们的结果显示, 胃癌组织中FTase β亚单位mRNA的表达明显高于癌旁组织, 两者相比有显著性差异(Z = 2.469, P = 0.014). FTase活性可能是胃癌发生的标志物.

研究表明, 约30%的人类肿瘤有ras基因突变, 并有Ras蛋白高表达, 突变的Ras蛋白可刺激细胞增殖和抑制凋亡从而促使肿瘤发生、发展. 因此Ras蛋白可作为抗肿瘤治疗的靶点. 业已证明, ras基因群第12、13、61位密码子点突变可使其获得转化细胞的能力, ras基因单点突变足以引发恶性转化. ras基因突变率在不同人类肿瘤有明显不同, 国外文献报道, 最高为胰外分泌腺癌, 达90%, 结肠癌为40%-50%, 肺癌和膀胱癌为40%[3,15], 而胃癌较低在10%以下. 但后者各家报道并不一致, 日本学者报告胃癌主要是K-ras基因点突变, Kihana et al[16]发现43%的胃腺瘤、95%的胃腺癌有K-ras基因点突变, 无H-ras突变; 南朝鲜人群中亦无H-ras突变; 对欧洲胃癌高发区人群研究未发现ras突变[17,18]; Deng et al[19]报道我国胃癌主要为H-ras基因点突变, 达41%. 此后国内多家学者报道胃癌中H-ras基因点突变率为13.6%-33.3%, K-ras基因点突变率为0-4.8%, 与邓国仁的结果相似, 并推测H-ras基因第12密码子点突变是中国人胃癌的特点之一[20,21]. 我们对标本H-ras基因第12密码子PCR扩增均成功, 43例胃癌组织中有1例发现突变（1/43, 2.3%）, 癌旁组织中未发现突变. 此结果与国内相关报道并不一致, 原因可能为胃癌的发生发展受诸如饮食、地理环境、种族差异等多因素的影响, 文献报道也证实某些胃癌相关基因(如ras)在不同地域、种族的表达确有差异, 所以虽同为中国人, 因所处地域不同, 饮食习惯差异, 因而H-ras基因的第12位密码子点突变率可以有很大差异.

我们的结果显示, 胃癌组织的FTase β亚单位mRNA 表达活性在女性、病理分型为印戒细胞癌的胃癌组织有显著升高, 与年龄、肿瘤部位、组织学分级、有无淋巴结转移及有无H-ras基因突变无关. 由于女性标本、印戒细胞癌的例数较少, 目前尚难定论女性或印戒细胞癌的胃癌病人FTase表达增高. 理论上, FTase是Ras蛋白在合成后加工修饰的关键酶, 通过它的作用Ras蛋白才可定位于细胞膜内侧, 才可发挥其在调控细胞的增殖、分裂与分化的作用, FTase活性的增高可能是源于ras基因的突变、Ras蛋白的高表达, 这一理论假说在近期的研究[12,13]中得到了证实. 本实验中FTase β亚单位mRNA的表达增高与H-ras基因的第12位密码子点突变无相关, 此结果的出现可能有以下原因: (1)哺乳动物的ras基因家族有3个成员, 分别是H-ras, K-ras, N-ras, 基因突变的最常见的方式就是点突变, 多发生在Ｎ端第12, 13和61密码子, 其中又以第12密码子突变最常见. 我们只检测了H-ras的第12位密码子点突变情况, 可能存在此基因其它位点或其他两型基因的不同位点的突变, 而导致Ras蛋白的高表达从而引起FTase β亚单位mRNA 的表达增高; (2)Ras蛋白只是FTase催化底物之一, 是否存在其他生物学因子调节胃癌组织中FTase表达还有待于进一步研究.

备注

电编: 李琪 编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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