HBV携带者T细胞亚群状况与肝组织病理学对比

摘要

目的: 研究HBV携带者的细胞免疫功能变化及其与血清HBV DNA, HBeAg的关系, 并对T细胞亚群与肝组织病理学改变进行对比分析, 探讨HBV携带及其所导致肝组织病理改变的机制.

方法: 应用流式细胞仪检测109例HBV携带者和40例健康对照外周血T细胞亚群百分率, 并对其中28例行肝组织病理学检查, ELISA法检测HBV标志物, PCR法检测HBV DNA.

结果: HBV携带者外周血CD3+、CD4+细胞百分率及CD4+/CD8+比值较正常对照组显著降低(67.2±9.0% vs 71.0±3.5%, P<0.05; 33.1%±6.6 vs 40.3±2.8%, P<0.001; 1.1±0.36 vs 2.01±0.19, P<0.001), CD8+细胞百分率明显升高(33.8±8.4% vs 20.2±1.9%, P<0.001). HBVDNA(+)组及HBeAg(+)组分别与HBV DNA(-)组及HBeAg(-)组比较, CD3+细胞无统计学差异, CD4+细胞显著降低(31.2±6.3% vs 37.2±5.4%, P<0.001; 31.0±6.0% vs 35.8±6.5%, P<0.001), CD8+细胞明显升高(36.7±8.4% vs 27.9±4.2%, P<0.001; 37.3±8.4% vs 29.5±6.0%, P<0.001), CD4+/CD8+比值明显降低(0.91±0.32 vs 1.35±0.26, P<0.001; 0.89±0.30 vs 1.26±0.33, P<0.001). HBVDNA(+)组肝病理组织学改变68.8%达到G1S1及以上程度, 而HBV DNA(-)组仅为16.7%, 二组间差异显著(c² = 5.57, P<0.01). G1S1组CD3+细胞较G1S0组明显降低(F = 2.919, P = 0.047), CD4+细胞降低(P>0.05). G2S1组与G1S0组相比, CD3+细胞及CD4+细胞百分率有降低趋势, CD8+细胞百分率有升高趋势, CD4+/CD8+比值有明显降低趋势.

结论: HBV感染可导致HBV携带者细胞免疫功能改变, HBV DNA复制增加可进一步加重HBV携带者的细胞免疫功能紊乱, 并加重肝组织损害.

关键词: HBV携带者; HBV DNA; 肝组织病理学; T细胞亚群; 免疫功能

Comparative analysis of peripheral T-cell subsets and liver histopathology in asymptomatic hepatitis B virus carriers

Jing You, Lin Zhuang, Hong-Ying Chen, Lan Yu, Jun-Hua Huang, Hui-Yun Gao, Yan-Wei Qiao, Bao-Zhang Tang, Jun-Yan Qu, Guo-Bin Wu

Jing You, Hong-Ying Chen, Lan Yu, Jun-Hua Huang, Hui-Yun Gao, Yan-Wei Qiao, Jun-Yan Qu, Guo-Bin Wu, Bao-zhang Tang, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Lin Zhuang, Department of Hepatopathy, the Third Municipal People's Hospital of Kunming, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Supported by: Scientific Research Foundation of Yunnan Education Office, No. 028Y213.

Correspondence to: Dr. Jing You, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, 295 Xichang Road, Kunming 650032, Yunnan Province, China. jingyoukm@163.com

Received: April 21, 2005
Revised: April 25, 2005
Accepted: April 27, 2005
Published online: November 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the influences of serum hepatitis B virus DNA and HBeAg levels on the function of cellular immunity and the changes of liver histopathology in asymptomatic chronic HBV carriers, and to explore the mechanism involved in it.

METHODS: Peripheral T-cell subsets were determined in 109 asymptomatic chronic HBV carriers and 40 normal controls by flow cytometry. Of the 109 carriers, histopathological examinations were performed in 28 ones. HBV markers were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and serum HBV DNA levels were measured by polymerase chain reaction (PCR).

RESULTS: The rates of CD3+ and CD4+ cells and the value of CD4+/CD8+ were significantly reduced in HBV carriers as compared with those in the normal controls (67.2%±9.0% vs 71.0%±3.5%, P < 0.05; 33.1%±6.6% vs 40.3%±2.8%, P < 0.001; 1.1%±0.36 vs 2.01±0.19, P < 0.001), and the rate of CD8+ cells was significantly increased (33.8±8.4% vs 20.2±1.9%, P < 0.001). The rates of CD3+ cells in HBV DNA(+) and in HBeAg(+) carriers showed no significant difference from those of HBV DNA(-) and HBeAg(-) carriers, respectively; However, the rate of CD4+ cells (31.2±6.3% vs 37.2±5.4%, P < 0.001; 31.0±6.0% vs 35.8±6.5%, P < 0.001) and the value of CD4+/CD8+ (0.91±0.32 vs 1.35±0.26, P < 0.001; 0.89±0.30 vs 1.26±0.33, P < 0.001) were markedly decreased, while the rate of CD8+ cells (36.7±8.4% vs 27.9±4.2%, P < 0.001; 37.3±8.4% vs 29.5±6.0%, P < 0.001) was increased in HBV DNA(+) and in HBeAg(+) carriers. The pathological changes that reached G1S1 stage covered a percentage of 68.8% in HBV DNA(+) carriers, which was significantly higher than that (16.7%) in HBV DNA(-) ones (c² = 5.57, P < 0.01). The rate of CD3+ cells was notably reduced (F = 2.919, P < 0.05) in G1S1 carriers as compared with that in G1S0 ones, but the rate of CD4+ cells showed no significant difference between them. Compared with those in G1S0 carriers, the rates of CD3+ and CD4+ cells and the value of CD4+/CD8+ tended to reduce, but the rate of CD8+ cells was tended to increase in G2S1 ones.

CONCLUSION: HBV infection can lead to disorder of cellular immunity in chronic HBV carriers, and the disorder and liver damages can be promoted by the increased serum levels of HBV DNA and HBeAg.

Key Words: Hepatitis B virus carrier; HBV DNA; Liver histopathology; T cell subsets; Immune function

0 引言

慢性病毒性肝炎是全球慢性肝病、肝硬化(LC)和肝细胞肝癌(HCC)的主要原因[1-4]. 乙型肝炎病毒(HBV)感染易于慢性化, 并逐渐发展成LC甚至HCC, 而严重威胁人类健康[5-7]. 我国约7亿人曾感染过HBV, 其中1.2亿人长期携带HBV, 其中的35%可发展为CHB, 65%可演变为LC, 80%的HCC与HBV感染有关[8-9]. 机体免疫功能状况与HBV长期携带有重要关系. 各种免疫细胞特别是Ｔ细胞亚群之间的调节紊乱, 不论原因来自宿主还是缘于病毒, 是体内不能清除病原体及HBV在肝内持续复制的主要原因[10-12]. 我们采用流式细胞仪检测HBV携带者外周血T淋巴细胞亚群[CD3+, CD3+/CD4+/CD8-(CD4+)(Th) , CD3+/CD4-/CD8+( CD8+)(Tc) , CD4+/CD8+(Th/ Tc)], 以评价HBV感染人体后细胞免疫功能的变化及其与血清HBVDNA的关系, 并对T淋巴细胞亚群检测结果与肝组织病理学结果进行对比分析, 从免疫学角度对HBV携带的机理及所导致的肝组织病理改变作一些探讨.

1 材料和方法

1.1 材料

HBV携带者109例均为我院住院及门诊病人. 男67例, 女42例, 年龄 13-50岁. 诊断符合2000年西安会议修订的诊断标准（HBsAg阳性, 但无肝炎症状和体证, 各项肝功能检查正常, 经半年观察无变化者）[13]. 其中HBsAg (+), HBeAg(+), HBcAb (+)61例; HBsAg(+), HBeAb (+), HBcAb (+)44例; HBsAg(+), HBcAb (+)4例. HBVDNA (+)74例, HBVDNA (-)35例. 全部患者排除甲、丙、丁、戍型肝炎及免疫缺陷性疾病, 以及肝癌、各种感染、风湿病和结核等, 半年内无应用免疫制剂史. 健康对照组 (health control, HC) (HBsAg阴性)40例. 年龄16-46岁, 均为健康体检合格人员, 无肝病病史及肝病证据.

1.2 方法

取全血 (EDTA抗凝) 100 µL 加三色mAb (CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE, 苏州生物基因公司) 20 µL, 混匀, 室温放置20 min. 放入Muti-Q-Prep处理仪(美国Coulter公司) 后, 用流式细胞仪(Coulter Epics-XL型流式细胞仪) 进行检测. 阴性对照取全血100 µL加小鼠IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE(苏州生物基因公司) 20 µL, 其余步骤同上. 血清乙肝标志物 (HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, HBcAb, Anti-HBcAbIgM) 检测用ELISA法, 血清HBV DNA检测用PCR法. 操作严格按试剂盒使用说明进行. 肝组织均采用快速抽吸术取得, 然后经固定, 石腊包埋切片染色后镜检, 并依据2000年西安会议修订的病毒性肝炎病理诊断标准, 进行炎症和纤维化程度的分级 (G) 和分期 (S) 诊断.

统计学处理 结果以均值±标准差(mean±SD)表示, 部分以百分率表示. 采用SPSS11.0软件包对各组间检测结果进行方差分析检验, 部分结果行c²检验.

2 结果

2.1 HBV携带者T细胞亚群

HBV携带者外周血CD3+细胞百分率及CD4+细胞百分率较正常对照组有明显降低(P<0.05及P<0.001); CD8+细胞百分率高于正常对照组(P<0.001); CD4+/CD8+比值明显降低(P<0.001, 表1). HBV携带者HBVDNA(+)组与HBVDNA(-)组间, CD3+细胞比较无显著性差异(P = 0.079), 但与HBVDNA(-)组相比, HBVDNA(+)组CD4+细胞百分率降低超过了6.06个百分点(P = 0.0001), CD8+细胞百分率升高超过了8.81个百分点(P = 0.0001), CD4+/CD8+比值显著下降(P = 0.0001). HBV携带者HBeAg(+)组与HBeAg(-)组间, CD3+细胞比较无显著性差异(P = 0.068), 但HBeAg(+)组CD4+细胞百分率降低超过了4.73个百分点(P = 0.0001), CD8+细胞百分率升高超过了7.84个百分点(P = 0.0001), CD4+/CD8+比值显著下降(P = 0.0001).

表1 HBV携带者T细胞亚群(mean±SD).

分组	n	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
HBV(+)	109	67.2±9.0a	33.1±6.6d	33.8±8.4d	1.1±0.36d
HBV(-)	40	71.0±3.5	40.3±2.8	20.2±1.9	2.01±0.19
HBVDNA(+)	74	68.3±8.7	31.2±6.3fd	36.7±8.4fd	0.91±0.32fd
HBVDNA(-)	35	65.0±9.4d	37.2±5.4b	27.9±4.2d	1.35±0.26d
HBeAg(+)	61	68.6±9.1	31.0±6.0hd	37.3±8.4hd	0.89±0.30hd
HBeAg(-)	48	65.4±8.7d	35.8±6.5d	29.5±6.0b	1.26±0.33d

^aP<0.05,

^bP<0.01,

^dP <0.001 vs HBV(-),

^fP <0.001 vs HBVDNA(-); ^bP<0.001 vs HBVDNA(-).

2.2 HBV携带者肝组织学结果

HBV携带者, 28例行肝穿刺术病理组织学检查, 其中HBVDNA(+)16例, 68.8%(11/16)病理组织学诊断达G1S1及其以上程度; 而HBVDNA(-)12例中, 绝大多数(83.3%)仅达G1S0程度, 二组间比较差异有显著性(P<0.01, 表2). HBVDNA(+)组与HBVDNA(-)组比较, CD3⁺细胞较HBVDNA(-)组升高, CD4⁺细胞较HBVDNA(-)组下降, 但差异均无显著性; CD8+细胞百分率HBVDNA(+)组显著升高超过了8.03个百分点(P = 0.008), CD4⁺/CD8⁺比值显著下降(P = 0.001, 表3). HBeAg(+)组与HBeAg(-)组之间, HBeAg(+)组CD4+细胞百分率降低超过了4.82个百分点(P = 0.039), 而CD3+细胞及CD8+细胞百分率升高分别超过了7.81、7.47个百分点(P = 0.030及P = 0.014), CD4+/CD8+比值显著下降(P = 0.0001). 病理组织改变为G1S0组CD3⁺细胞显著高于G1S1组(F=2.919, P = 0.047), 病理组织改变为G1S1组CD4+细胞低于G1S0组, 但差异无显著性, CD8⁺细胞及CD4⁺/CD8⁺比值在各病理组织改变组间差异均无显著性.

表2 HBV携带者肝组织学结果.

分组	例数	G1S0	G1S1	G2S1	≥G1S1
HBVDNA(+)	16	31.3 (5/16)b	56.3 (9/16)a	12.5 (2/16)	68.8 (11/16)b
HBVDNA(-)	12	83.3 (10/12)	16.7 (2/12)	0	16.7 (2/12)
c2值		5.57	4.71	0.86	5.57
P值		0.006	0.034	0.204	0.006

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs HBVDNA(-).

表3 28例肝活检HBV携带者T细胞亚群检测结果(mean±SD).

分组	例数	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
HBVDNA(+)	16	69.1±10.6	35.01±6.8d	37.3±9.2fd	0.99±0.26hd
HBVDNA(-)	12	66.3±8.3b	38.4±5.0	29.2±2.9d	1.32±0.16d
HBeAg(+)	12	72.4±9.0a	33.7±4.2ad	38.1±9.3ad	0.94±0.26gd
HBeAg(-)	16	64.6±8.9d	38.5±6.7	30.6±5.7d	1.27±0.19d
HBV(-)	40	71.0±3.5	40.3±2.9	20.2±1.9	2.01±0.19
G1S0	15	71.4±10.3	37.7±5.7	34.7±9.4	1.16±0.33
G1S1	11	62.8±7.3	35.2±7.3	32.3±7.3	1.12±0.22
G2S1	2	69.5±0.8	34.8±0.5	35.6±0.9	0.98±0.01
G1S1+G2S1	13	63.9±7.1	35.1±6.7	32.8±6.8	1.10±0.20

^bP<0.01 vs HBV(-); ^fP<0.01, ^hP<0.001 vs HBVDNA(-);

^aP<0.05, ^gP<0.001 vs HBeAg(-); G1S0, G1S1, G2S1及G1S1+G2S1四组间CD3见显著性差异(F = 2.919, P = 0.047).

3 讨论

长期以来, 人们普遍认为HBV感染的慢性化主要是机体细胞免疫功能低下所致, 但其机制并未完全阐明. 对HBV呈完全免疫耐受则表现为慢性携带者, 对HBV免疫功能低下, 即对HBV抗原有一定识别和清除能力, 从而导致一定的肝细胞损害, 则表现为慢性肝炎[14]. 研究[15-28]发现, 慢性乙肝患者及HBV携带者与健康对照比较CD4, CD4/CD8下降, CD8升高. 而CD3的检测结果各不相同, 如有研究发现CD3较健康对照降低[19-21,25,29-30]、升高[21] , 或与正常组比较无显著差异[23,31-32]. 本研究支持CD3较健康对照降低的结论, 发现HBV携带者较健康对照者CD4显著下降, CD8明显升高, CD4/CD8比值降低, 差异具有显著性. 表明HBV携带者体内细胞免疫功能低下, 这与HBV阳性患者血中CD4+细胞易被感染而成为靶细胞有关[33], 因而也可能是病毒持续存在而导致感染慢性化的原因之一[34]. HBVDNA(+)组与HBVDNA(-)组比较, CD3⁺细胞无显著性差异, CD4⁺细胞减低、CD8⁺细胞增高, 且CD4⁺/CD8⁺比值下降均具显著性差异(P<0.001). HBeAg(+)组与HBeAg(-)组比较, CD3⁺细胞无显著性差异, CD4+细胞减低、CD8⁺细胞增高, 且CD4+/CD8+比值下降均具显著性差异(P<0.001). 提示HBV携带者各T细胞亚群改变不仅与HBV感染有关, 也与HBVDNA复制与否有关, 随着HBVDNA复制增加, 可能进一步导致HBV携带者细胞免疫功能紊乱. Baroja等[35-36]认为HBV携带者HBVDNA(+)组、HBVDNA(-)组与对照组相比, CD3⁺细胞百分率无统计学差异, HBeAg(+)和HBeAb(+)的HBV携带者与正常对照组相比, CD4⁺下降, CD8+增高, CD4⁺/CD8⁺显著减低, 与本文结果相似. 提示HBeAg在导致HBV携带者T细胞亚群改变中起关键作用. 首先, 在HBV感染的垂直传播中可起耐受原作用[37-38], 在血液中主要使Th1缺失, 特异的Th2可能启动或维持慢性携带状态, 故特异的Th₂细胞与Th₁相比, 优势诱导免疫耐受性, 这种Th₂对Th₁细胞的优势性进一步抑制机体的细胞免疫功能, 导致病毒不能被机体清除, 形成出生后的慢性感染[39]. 在HBeAg转基因小鼠, Th1对HBeAg的应答低于Th2样细胞. 其次, 起诱导原的作用, 诱导Ts细胞增值, 加重免疫抑制[40-43]. 所以HBV携带者T细胞亚群较健康人发生一系列改变: CD4⁺（主要为Th₁ 细胞）减少, CD8⁺增高, CD4⁺/CD8⁺比值下降(提示免疫功能下降).

HBV利用寄居的肝细胞的生命机构进行复制, 但不太妨碍细胞代谢, 无直接致细胞病变效应, 因而不出现明显的病变[44]. 肝细胞损伤是免疫应答的结果. HBV携带者肝组织可无改变, 也可出现由轻微病变至肝硬化的系列慢性肝病谱. 肝活体组织检查结果正常者仅约10%, 灶性炎症和非特异性反应性炎症45%, 轻度慢性肝炎约25%, 有明显小叶病变的慢性肝炎和活动性的慢性肝炎各约10%, 其中有个别已是早期肝硬化[44]. Chon等[45]对ALT正常、无肝大的110例ASC肝组织学研究结果提示, 24.5%(27/110)肝组织学诊断正常, 46.4% (51/110)有慢性肝病(其中LC 3例, 有LC的CAH 4例, CAH11例, CPH33例), 其余29.1%(32/110)有非特异的组织学异常. 并认为ASC无肝组织病变的报告多来自HBV感染的低发地区. Agalar等[46]研究认为ALT正常的ASC肝活体组织检查未发现中、重度肝炎. 本研究结果表明, 所有(28例行肝组织病理学检查者)HBV携带者均有不同程度的炎症和纤维化改变, 其中的16例HBVDNA(+)者中68.8%(11/16)病理学诊断达G1S1及其以上程度, 但无重度肝炎和肝硬化改变者; 而HBVDNA(-)者中绝大多数(83.3%)仅达G1S0程度. 提示HBV携带者的肝组织炎症及纤维化改变程度与HBV复制水平相关. 与HBVDNA(-)组相比, HBVDNA(+)组CD4⁺细胞下降(但差异无显著性), CD8⁺细胞则明显升高, CD4⁺/CD8⁺比值显著下降. 与HBeAg(-)组相比, HBeAg(+)组CD4+细胞显著下降, CD8+细胞则明显升高, CD4+/CD8+比值显著下降. 提示HBV携带者的T细胞亚群改变与HBV复制水平相关. 以上结果间接提示HBV携带者的肝组织学改变程度与其T淋巴细胞亚群改变程度相关, 进一步对不同程度肝病理组织改变的HBV携带者T细胞亚群检测结果的分析表明, 肝组织学G1S1组CD3⁺细胞显著低于G1S0组, 差异有显著性; G1S1组CD4^＋细胞低于G1S0组, 但差异无显著性; CD8⁺细胞及CD4⁺/CD8⁺比值在各病理组织改变组间差异无显著性, 但G2S1组与G1S0组相比, 有CD8+细胞升高、CD4⁺细胞降低及CD4^＋/CD8⁺比值降低趋势. 提示随肝组织病理改变程度的加重, CD4⁺细胞相应降低, CD8⁺细胞相应增高, CD4⁺/CD8⁺比值下降.

备注

电编: 李琪 编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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