磷酸化黏着斑激酶在结肠癌中表达及意义

摘要

目的: 观察磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phospho-FAK)在结肠癌组织和对应癌旁组织中的表达, 探讨其在结肠癌发病的可能机制.

方法: 采用Western bloting方法检测20例新鲜结肠癌及相对应的癌旁组织FAK表达水平, 并在调平每对组织FAK的含量后再进行FAK Tyr397磷酸化蛋白的检测.

结果: 20例结肠癌组织FAK阳性表达率为95%, 对应癌旁组织FAK阳性表达率为60%(χ² = 5.16, P<0.05); 癌组织表达平均值为0.482±0.150, 癌旁表达平均值为0.269±0.015(t = 6.39, P<0.01). 20例结肠癌组织18例有FAK Tyr397磷酸化蛋白表达, 表达率为90%, 而对应癌旁组织仅有4例有FAK Tyr397磷酸化蛋白表达, 表达率为20%(χ² = 17.1, P<0.01); 癌组织表达平均值为0.385±0.021, 癌旁表达平均值为0.110±0.005(t = 54.23, P<0.01).

结论: FAK特别是FAK Tyr397磷酸化蛋白的表达水平增加在结肠癌的发生、发展中可能起重要作用.

关键词: 结肠癌; 黏着斑激酶; 磷酸化

Expression and significance of phosphorylated focal adhesion kinase in colon carcinoma

Qi-Sheng Liu, Hong-Gang Yu, Yuan-Ling Qi, Jun Cao, He-Sheng Luo, Jie-Ping Yu

Qi-Sheng Liu, Hong-Gang Yu, Yuan-Ling Qi, Jun Cao, He-Sheng Luo, Jie-Ping Yu, Department of Gastroenterology, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30470782.

Correspondence to: Hong-Gang Yu, Department of Gastroenterology, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China. wuzhixuan2003@126.com

Received: September 28, 2005
Revised: September 29, 2005
Accepted: September 30, 2005
Published online: October 28, 2005

Abstract

AIM: To investigate the expression of phosphorylated focal adhesion kinase (phospho-FAK) and its signific-ance in human colon carcinoma.

METHODS: The phospho-FAK (including FAK) expre-ssion was detected by Western bloting in 20 cases of colon carcinoma and their corresponding para-cancer tissues.

RESULTS: The positive rate of FAK expression in the cancer tissues was significantly higher than that in the corresponding normal tissues (95% vs 60%, χ² = 5.16, P <0.05). The mean level of FAK expression in the cancer tissues was 0.482±0.150, while the mean level of expression in the normal tissue was 0.269±0.015 (t = 6.39, P <0.01). The positive rate of Tyr-397 FAK protein expression in the cancer tissues was 90%, while the positive rate in the corresponding normal tissues was only 20% (χ² = 17.1, P <0.01). The mean level of Tyr-397 FAK protein expression in the cancer tissue was notably higher than that in the corresponding para-cancer tissues (0.385±0.021 vs 0.110±0.005, t = 54.23, P <0.01).

CONCLUSION: The up-regulation of FAK expression, especially Tyr-397 FAK protein expression, may play an important role in the tumorigenesis and progression of colon carcinoma.

Key Words: Colon carcinoma; FAK; Phosphorylation

0 引言

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤, 随着生活条件的改善, 饮食西化, 我国结肠癌发病率上升趋势非常明显, 但其发病机制尚未完全明确. 黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体蛋白酪氨酸激酶, 分布在细胞黏着斑部位, 相对分子质量为M_r 125 000, 是整合素介导的细胞与细胞外基质之间信号事件的关键性调节分子, 参与调节细胞的多种生物学功能[1]. 研究表明, 在多种肿瘤组织中都有FAK特别是磷酸化FAK表达显著增加, 且磷酸化FAK的表达与肿瘤的发生及生物学行为(如增殖、凋亡、黏附、迁移等)有一定的相关性. 为此我们采用western bloting方法在组织水平上进一步证实FAK在结肠癌组织及对应癌旁组织中的表达, 特别是对于对肿瘤侵袭和转移密切相关的磷酸化形式的FAK, 以探讨它们的表达与结肠癌发病的关系.

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 组织标本: 收集武汉大学人民医院及中南医院2005-02/2005-07手术切除的结肠癌新鲜标本20例. 每例手术切除的标本均取癌组织、对应癌旁组织(距癌组织>5 cm)各1份, 液氮冷冻后置-70℃冰箱保存. 所有标本均经HE染色病理证实, 其中男12例, 女8例, 年龄25-79岁(平均56.2岁), 所有患者术前均未接受放、化疗.

1.1.2 主要试剂: 兔抗FAK多克隆抗体(cell signaling), 兔抗磷酸化FAK Tyr397多克隆抗体(upstate biotechnology). 羊抗兔IgG-HRP, 预染蛋白Mark-er(pierce signaling). ECL试剂盒(Santa Cruz Biotechnology). 硝酸纤维素膜(Amersham). Aprotinin、Leupeptin、Pepstalin、PMSF等(武汉天源生物技术公司).

1.2 方法

1.2.1 总蛋白的提取: 取约100 mg组织标本, 加入1 mL组织裂解液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 10 g/L脱氧胆酸钠, 10 mL/L NP40, 10 g/L SDS, Aprotinin、Leupeptin、Pepstalin均为1 g/L, PMSF 1 mmol/L), 匀浆, 操作均在冰上进行. 13 000 g, 4℃离心10 min. 取上清置于Ep管. 用Bradford法测定蛋白浓度.

1.2.2 Western bloting: 参照《分子克隆》中的实验方法, 以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照, 每个标本至少重复3次进行SDS-PAGE电泳, 并转至硝酸纤维素膜上, 室温封闭2 h后, 用TBST缓冲液漂洗3次, 再加入兔抗人FAK抗体(1∶1 000), 4℃孵育过夜, TBST缓冲液漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000), 室温摇床孵育2 h, 增强化学发光系统显色, 暗室内X光底片感光成像.

1.3 图像分析及处理

采用法国Bio-profil图像分析系统对western印迹结果进行图像分析, 并根据条带的积分吸光度值对FAK进行蛋白量的调平, 使每对组织中所含FAK的蛋白量相等, 再用同样方法对FAK Tyr397磷酸化蛋白行western印迹检测(方法同上), 以比较调平后每对组织FAK Tyr397磷酸化蛋白的表达差异. 将每个样本FAK的积分光密度值与β-actin的积分光密度值相比, FAK Tyr397磷酸化蛋白的积分光密度值与相应调平后FAK的积分光密度值相比, 分别得出积分光密度比值. 以比值代表它们的蛋白质含量.

统计学处理 计数资料采用卡方检验和四格表的精确概率法, 计量资料采用t检验, 均以P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 FAK蛋白在结肠癌及相应癌旁组织的表达

20例结肠癌组织中有19例可见不同浓度的FAK阳性带(图1), 其在结肠癌组织的阳性表达率为95%, 而对应癌旁组织有12例出现不同浓度的FAK阳性带, 阳性表达率为60%(χ² = 5.16, P<0.05, 表1), 在与β-actin的积分光密度值相比中癌组织表达平均值为0.482±0.150, 癌旁表达平均值为0.269±0.015, FAK在结肠癌组织的表达水平高于癌旁组织(t = 6.39, P<0.01, 表1).

表1 FAK在结肠癌及相应癌旁组织的表达(n = 20).

组别	阳性表达率 (%)	FAK/β-actin (mean±SD)
癌旁组织	60	0.269±0.015
癌组织	95b	0.482±0.150d

^bP<0.05,

^dP<0.01 vs 癌旁组织.

图1 癌与癌旁组织的FAK表达. N: 癌旁组织; C: 癌组织.

2.2 在把每对组织的FAK含量调为一致后, 20例结肠癌组织中有18例可见不同浓度的FAK Tyr397磷酸化蛋白阳性带(图2), 表达率为90%, 而对应癌旁组织仅有4例出现较低浓度的FAK Tyr397磷酸化蛋白阳性带, 表达率为20%(χ² = 17.1, P<0.01, 表1), 在与对应的FAK积分光密度值相比中, 癌组织表达平均值为0.385±0.021, 癌旁表达平均值为0.110±0.005(t = 54.23, P<0.01, 表2).

表2 FAK Tyr397在结肠癌及相应癌旁组织的表达(n = 20).

组别	阳性表达率 (%)	P-FAK/FAK (mean±SD)
癌旁组织	20	0.110±0.005
癌组织	90b	0.385±0.021d

^bP<0.01,

^dP<0.01 vs 癌旁组织.

图2 调平总FAK后FAK Tyr397的表达. N: 癌旁组织; C: 癌组织.

3 讨论

FAK是Schaller et al 1992年发现的能使Src内源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物, 是一种重要的非受体蛋白酪氨酸激酶(non-receptor protein tyrosine kinases)[1]. FAK并不是癌基因, 但其在肿瘤中表达明显增高. 国内外众多学者报道了FAK在不同来源的肿瘤中均表达上调[2-5], 并与肿瘤的浸润转移存在密切关系. FAK有6个可以被磷酸化的酪氨酸位点, 其中Tyr397为自主磷酸化位点, 是一个极其重要的磷酸化位点. 当黏着斑形成后, Tyr397首先发生自身磷酸化, 同时Tyr397磷酸化后可以直接与含SH₂结构区域的信号分子如Src、PI-3K等结合. Src与FAK两者结合形成FAK/Src复合物后能够彼此激活, 活化的Src可催化FAK的其他酪氨酸磷酸化位点使其发生磷酸化, 从而使FAK完全激活[6], 亦使FAK信号传导通路活化, 启动下游相应的重要事件发生. Tyr397作为整个事件的启动点, 其作用显得尤为突出[7], 因此Tyr397的磷酸化水平可反映胞内FAK的活化状况. 最近也发现在结肠腺瘤向结肠癌的转化过程中, FAK特别是FAK Tyr397磷酸化蛋白的表达逐渐升高[8].

目前关于临床肿瘤标本中FAK磷酸化状态的报道尚少, 在本实验中, 我们采用免疫印迹方法测定FAK和Tyr397-FAK, 它比单纯测定FAK更能反应肿瘤的演变过程、侵袭和转移等生物学行为. 本实验结果也显示Tyr397-FAK磷酸化蛋白在癌及癌旁组织中的表达率及表达水平均有明显差异.

FAK介导多条信号传导通路, 是细胞内多条信号传导通路的交汇点. 许多因子都可激活FAK使其磷酸化, 而磷酸化FAK表达的上调被认为在肿瘤发生、发展多个方面中起着重要作用, 诸如增殖、扰乱细胞-细胞接触、运动、侵袭、抗凋亡以及血管生成等[9]. 我们通过敏感性很高的western bloting方法直接比较结肠癌组织和相对应癌旁组织的FAK蛋白表达, 而且为了更好的说明FAK Tyr397磷酸化蛋白的重要性, 特意调平每对组织的FAK蛋白后再次比较FAK Tyr397磷酸化蛋白表达, 而不是在总蛋白量相同下进行比较, 这样就使研究在相同的遗传背景下进行, 从而提高结果的可信度. 本实验结果表明结肠癌组织中FAK蛋白和FAK Tyr397磷酸化蛋白的表达均高于对应的癌旁组织. 特别是在FAK蛋白表达相同的情况下, 癌组织与癌旁组织中的FAK Tyr397磷酸化蛋白表达仍然有明显差异性, 这可能说明在肿瘤的发生、发展中起关键作用的是活化的FAK蛋白, Yu et al[10]和Glover et al[11]从细胞水平也分别证实FAK Tyr397磷酸化蛋白随刺激因素的时间和剂量增加而增加, 且有明显的因果关系, 刺激的作用是引起FAK Tyr397磷酸化, 而不是促进FAK蛋白的表达, 在许多癌旁组织中也有中低度表达的FAK, 这可能是因为FAK本身并不是癌基因的缘故, FAK在成熟组织和许多细胞株中均可能有表达, 但只是表达强度较弱, 而FAK Tyr397磷酸化蛋白在癌旁组织中几乎无表达, 这更加说明了磷酸化的FAK在肿瘤的多个方面所起到的重要作用. 细胞实验中增加FAK的磷酸化可促进细胞运动、增加细胞侵袭力等细胞生物学改变[12,13], 这说明了磷酸化的FAK在肿瘤的发生、浸润、转移中起重要的作用. 我们同样认为结肠癌由于磷酸化FAK表达的增加, 导致肿瘤发生并加速恶性细胞的增殖、浸润和转移. 因此测定FAK Tyr397磷酸化蛋白的表达比单纯测定FAK更能有效预示肿瘤的发生、发展和预后, 可以作为一个肿瘤标记物.

有基于此, 通过应用FAK磷酸化抗体、抑制剂[14]及其过表达FAK的显性负抑制子(FAK-related non-kinase, FRNK)[15]等可抑制FAK的磷酸化, 来达到抑制癌细胞增殖、降低侵袭力、运动及转移等, 这有望成为结肠癌治疗的新领域.

备注

电编: 张敏 编辑: 菅鑫妍 审读: 张海宁

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