基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-10-28; 13(20): 2420-2426
在线出版日期: 2005-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i20.2420
二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因
阚卫兵, 方肇勤, 管冬元, 赵晓珍, 吴中华, 盛学仕, 高必峰
阚卫兵, 中国上海中医药大学附属普陀医院 上海市 200062
方肇勤, 管冬元, 赵晓珍, 吴中华, 盛学仕, 中国上海中医药大学 上海市 201203
高必峰, 科罗拉多大学医学院 美国科罗拉多州 80220
阚卫兵, 男, 1970-01-16生, 山东省郯城县人, 汉族, 2005年上海中医药大学博士毕业, 主治医师, 主要从事中医药的分子生物学实验研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30271576.
通讯作者: 方肇勤, 201203, 上海市浦东区张江蔡伦路1200号, 上海中医药大学中医基础学院实验中医学教研室. zqfang@sh163d.sta.net.cn
电话: 021-51322119
收稿日期: 2005-05-08
修回日期: 2005-06-01
接受日期: 2005-06-15
在线出版日期: 2005-10-28

目的: 首次大范围地观察二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌组织基因表达的差异, 探索DEN诱发肝癌的分子机制.

方法: DEN诱导大鼠肝癌, 常规抽提和纯化RNA, 采用Affymetrix Rat 230A GeneChip及技术比较肝癌组织与正常大鼠肝组织基因表达的差异.

结果: 在芯片的15 710个基因中, 肝癌有84.54%的基因阳性表达, 肝癌基因表达在正常肝脏5倍以上的有509个, 其中325个为EST片段, 已知基因184个, 其中的168个基因可以检索到有关文献的报道. 在这168个基因中, 有100个基因被发现与肿瘤有关, 其中有36个与肝癌有关; 有4个基因与肝脏有关; 另有64个基因与肿瘤和肝脏无关.

结论: DEN诱发大鼠肝癌的后基因组变化中168个基因值得优先关注.

关键词: 肝癌; 基因; 基因芯片; 大鼠; 二乙基亚硝胺
引文著录: 阚卫兵, 方肇勤, 管冬元, 赵晓珍, 吴中华, 盛学仕, 高必峰. 二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因. 世界华人消化杂志 2005; 13(20): 2420-2426
Up-regulated genes in diethylnitrosamine-induced liver cancer in rats
Wei-Bing Kan, Zhao-Qin Fang, Dong-Yuan Guan, Xiao-Zhen Zhao, Zhong-Hua Wu, Xue-Shi Sheng, Bi-Feng Gao
Wei-Bing Kan, Affiliated Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Zhao-Qin Fang, Dong-Yuan Guan, Xiao-Zhen Zhao, Zhong-Hua Wu, Xue-Shi Sheng, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Bi-Feng Gao, Medicial College of Coloroda State University, 80220 Coloroda, United States
Correspondence to: Zhao-Qin Fang, Department of Laboratory Medicine, College of Laboratory Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 1200 Zhangjiang Cailun Road, Pudong District, Shanghai 201203, China. zqfang@sh163d.sta.net.cn
Received: May 8, 2005
Revised: June 1, 2005
Accepted: June 15, 2005
Published online: October 28, 2005

AIM: To investigate the differentially expressed genes in rat liver cancer induced by diethylnitrosamine (DEN), and to explore mechanism in DEN-induced carcinogenesis.

METHODS: The model of liver cancer was induced by DEN. The RNA was extracted purified from the cancer cells with routine methods. Affymetrix Rat 230A GeneChip and technique were used to detect the dis-crepancies of gene expression between tissues of nor-mal control and liver cancer.

RESULTS: Of 15710 genes in the GeneChip, the positive expression covered a percentage of 84.54% in liver cancer. There were 509 genes whose expression levels in liver cancer were about 5 times as high as those in the normal controls, of which 325 were EST fragments. Of the 325 genes, 184 ones were with known function, of which 168 had been reported in relevant references. Of the 168 genes, 100 ones were associated with the tumor (36 with liver cancer), 4 with liver, and the other 64 had no relation with tumor and liver.

CONCLUSION: DEN-induced up-regulations of genes in liver cancer are fairly complicated, of which 168 ones need paying more attention to.

Key Words: Liver cancer; Gene; GeneChip; Rats; Diethylnitrosamine
0 引言

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤, 其发病隐匿、恶性程度高、预后差, 严重威胁到人类的身心健康. 因而探求肝癌的发病机制, 寻求有效的治疗方法, 一直是基础医务工作者努力的方向. 二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌涉及到多基因的改变[1-8], 为更广泛地揭示DEN诱发大鼠肝癌肝组织基因表达的差异, 上海中医药大学与美国科罗拉多大学医学院联合采用Affymetrix Rat 230A GeneChip芯片对大鼠肝组织进行了基因检测.

1 材料和方法
1.1 材料

♂wistar大鼠, 24只, 体质量100-120 g, 随机分为2组, 正常与模型组各12只, 常规饲养, 模型组大鼠自由饮用80 µg/L DEN水溶液, 至20 wk处死动物. 取出肝脏立即进行RNA抽提. 采用GIBCO公司Trizol试剂盒及其方法抽提肝(含肝癌)组织总RNA, 采用RNeasy Mini试剂盒及其操作手册方法纯化RNA. 纯化后, RNA的A260和A280的比值在1.9-2.1之间. 用Agilent 2100 Bioanalyzer检测总RNA并确认其完整性. 每组动物随机取5份纯化后的RNA, 混匀、合并成一份样本, 定量. 将总RNA转录为双链cDNA, 用基因芯片纯化模块(Affymetrix)净化和复原双链cDNA.

1.2 方法

以双链cDNA为模板, 用RNA转录标记试剂盒在生物素标记核糖核苷酸混合物中进行转录, 转录产生生物素标记的cRNA. 用基因芯片纯化模块(Affymetrix)净化生物素标记cRNA. 将cRNA在94℃断裂缓冲液(在10 mL/L Tween 20中添加100 mol/L MES、1 mol/L Na+、20 mol/L EDTA)中孵育35 min使其变为50-200个碱基的片段. cRNA片段的最终浓度定量为0.05 g/L. 每样本取200 µL和Affymetrix Rat 230A GeneChip® arrays芯片在GeneChip® Hybridization Oven 640(Affymetrix)杂交箱中, 45℃下杂交孵育16 h. 杂交完成后, 去除杂交液, 冲洗芯片, 用GeneChip® Fluidics Station 450(Affymetrix)对芯片行抗生蛋白链菌素-藻蓝蛋白染色. 用分辨率为2.5-3 µm的GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)扫描读取芯片信息.

统计学处理 详细步骤和灵敏度问题以及定量的方法参考Affymetrix genechip网站的技术手册.

2 结果

DEN诱发大鼠肝癌成功, 造模至20 wk时, 模型组大鼠均出现肝癌. Affymetrix Rat 230A GeneChip检测结果, 肝癌组织有84.54%(每张芯片含有15 710个基因)的基因有表达, 芯片杂交后扫描图见图1, 其中肝癌组织基因表达大于正常基因(大于2倍)计2 796个(图2). 将肝癌组织与正常肝组织所测的读数数值比较, 求出比值, 按比值由高到低排序, 剔除比值小于5倍的, 以及肝癌组织表达值读数在50以下的基因, 共得到509个基因, 其中325个基因是EST(未知基因)片段, 184个为已知基因. 通过PubMed先后采用基因名称加Liver cancer、基因名称加cancer, 以及基因名称加Liver的检索方法, 对186个基因的20 a内的国外文献检索后, 统计表明: 已知基因中有16个基因在国外文献报道较少或无报道, 168个基因中有100个基因与肿瘤有关(其中有36个基因与肝癌有关), 4个基因与肝脏有关, 64个基因与肿瘤和肝脏无关(在文章中只是涉及到肿瘤和肝癌, 而非专门探讨的也归于此类). 兹将比值最高的前168个基因, 依据正常肝脏表达与否(表达读数小于50者计为不表达)依次归类如下.

图1
图1 芯片杂交后扫描图.
图2
图2 正常大鼠肝脏与肝癌基因表达比较. 图2中纵坐标为肝癌表达基因读数, 横坐标为正常肝脏表达基因读数; 图2中红色表示表达阳性的基因, 蓝色为疑似表达的基因, 黄色为接近阴性表达的基因; 为了在绘图中能够更好的体现杂交后数值的差异性, 图2采用Log2数值作图以描述其差异.
2.1 肝癌组织表达大于正常肝脏的基因

这类基因, 在正常肝脏中有一定数量的表达, 大多表达数量很少. (1)肝癌组织表达大于(30倍以上)正常肝脏的基因, 3个基因在肝癌期间出现非常高的表达, 大于正常肝脏表达的30倍以上(表1). (2)肝癌组织表达大于(30倍以下)正常肝脏的基因(图3).

表1 肝癌组织表达大于(30倍以上)正常肝脏的基因.
Genbank编号基因名称英文 (缩写和中文)芯片读数 肝癌/肝脏比值
56335Glutathione-S-transferase, placental enzyme pi type(GST-pi, 谷胱甘肽-S-转移酶pi)21 055/55537
3817620Aldose reductase-like protein (ARL-1, 醛糖还原酶相似蛋白)12 703/121104
1177817UDP-glucuronosyltransferase (UGT, 尿苷二磷酸-葡糖醛酰转移酶)9 203/11480
图3
图3 肝癌组织表达大于(30倍以下) 正常肝脏的基因.
2.2 肝癌独特表达的基因

这类基因, 按照Affymetrix芯片数据处图理, 正常肝脏所表达均为阴性, 其芯片读数大多在50以下. 这类基因共有107个. (1)肝癌组织表达大于正常肝脏30倍以上的基因(图4). (2)肝癌组织表达大于正常肝脏30倍以下的基因(图5).

图4
图4 肝癌独特表达的基因(表达大于正常肝脏30倍以上).
图5
图5 肝癌独特表达的基因(表达大于正常肝脏30倍以下).
3 讨论

在以上的众多基因中, 以胰岛素样生长因子2(IGF-2)、p75NTR关联细胞死亡执行子(NADE)、细胞周期依赖性激酶抑制基因(p16Ink4a)三个基因与肿瘤的关系尤为突出, 现将这三个基因的最新研究以及与肿瘤的关系进行简单的阐述.

3.1 IGF-2

人类的IGF-2是肝细胞自分泌和/或旁分泌的生长因子之一. Lee et al[9]用黄曲毒素B1(AFB1)诱导的p53基因突变体p53mt249肝细胞癌, 发现肝癌形成中p53mt249通过IGF-2启动子4显著增加了IGF-2的转录表达, 使胎儿型IGF-2积累. IGF-2启动子4可以被野生型的p53和p53mt249所识别, 野生型p53抑制转录因子Sp1和TBP在启动子4上的结合; 而p53mt249在野生型p53不在的情况下, 可以刺激转录因子Sp1的磷酸化, 从而增加转录因子结合在启动子4上. p53mt249转染被HBV-X蛋白和TNF-α诱导凋亡的肝细胞, 可以通过增加IGF-2的产量而阻滞该细胞凋亡. 这个结果解释了诱变剂AFB1诱导的p53mt249突变体诱发肝细胞癌的分子机制. Fan et al[10]发现在正常的成年肝组织中IGF-2和IGF-2R是很少表达的, 而其mRNA在慢性肝炎, 肝细胞癌, 肝硬化中分别约有33.3%, 66.7%, 72%的病人是高表达的. IGF-2和IGF-2R在肝细胞癌Ⅰ- Ⅲ级(Edmondson 分级)的阳性率分别为0.25%, 76.2%, 100%. 另一研究发现[11], 乙型肝炎X病毒蛋白(HBx)在诱导肝细胞瘤形成过程中, 通过被蛋白激酶C或分裂活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化的Sp1刺激IGF-2表达. PTEN在肝细胞瘤细胞株中的表达, 使Sp1被去磷酸化, 诱导Sp1与DNA结合的降低, 阻滞HBx激活IGF-2的转录. PTEN阻断了PKC、MAPK和MAPK激酶对Sp1磷酸化作用, 在肝细胞瘤形成过程中下调了IGF-2的表达. Scharf et al[12]也观察到IGF-2和IGF-2受体在肝细胞癌和肝细胞瘤细胞株中高表达. 此外, IGF-2在胃癌的发病机制中也起到重要作用, 而血浆IGF-2水平的升高与肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的严重程度呈正相关[13,14].

3.2 NADE

NADE最初是从人类卵巢卵泡细胞cDNA文库克隆出来的, 作为不明蛋白命名为pHGR74, 调节神经生长因子诱导的凋亡. Mukai et al[15]通过酵母双杂交系统筛选了p75NTR联合蛋白, 并命名为p75NTR关联细胞死亡执行子(NADE). 鼠的NADE与人类的HGR74蛋白具有显著同源性, NADE特定结合在p75NTR的细胞死亡结构域, 在293T细胞中两者共同表现诱导激活caspase-2、caspase-3和细胞核DNA断裂. 在缺失p75NTR时, NADE不能诱导凋亡. 在PC12、nnr5细胞株和少突胶质细胞得到同样的结果. 在被神经生长因子诱导的包含p75NTR介导的凋亡中, NADE是第一个信号衔接分子, 它在神经遗传学的发病机制中扮演一个重要角色. Mukai et al[16]报道NADE是p75NTR联合蛋白, 通过和p75NTR死亡结构域的结合响应NGF介导凋亡. NADE有4个亚型: NADE2、 NADE3、NADE4/Bex1和NADE5/Bex2. NADE在NGF诱导的少突胶质细胞凋亡和锌离子诱导的神经元死亡中起到重要作用. Tong et al[17]从乳腺癌细胞株中分离出人类的NADE(pHGR74). 研究还发现NADE在人类的内分泌器官和鼠的胚胎组织是高表达的. NADE在中国仓鼠卵巢细胞株和人类MDA-MB-231乳腺癌细胞株中表达, 对细胞有抑制生长的作用.

3.3 p16Ink4a

该基因是细胞周期依赖性激酶抑制基因, 其表达的蛋白可直接与CDK4和CDK6结合而阻止其与cyclinD结合, 也可与cyclin-CDK复合物结合抑制其活性, 从而抑制pRb蛋白磷酸化和转录调节因子E2F的释放, 借此参与细胞周期调节, 促成细胞周期停滞. Pang et al[18]对68例肝细胞癌进行了研究, 证实p16Ink4a甲基化率为61.7%. 认为该基因的甲基化在肝硬化向肝癌的转变中起到重要作用. Jarmalaite et al[19]研究了64例与吸烟有关的肺癌, 发现肿瘤组织中p16Ink4a的甲基化约34%. 认为p16Ink4a基因启动子的CpG-岛的甲基化, 是导致抑癌基因失活的重要原因. Lee[20]对8个正常的骨髓、3个反应性粒细胞增多的病人和21个恶性血液病的病人p16Ink4a mRNA的表达进行了研究, 发现p16Ink4a在正常的骨髓仅有少量的表达, 而在血液恶性肿瘤病人中表达异常增高(P<0.05), 认为该基因高表达可能与血液学恶性肿瘤的发病机制有关.

在正常和肝癌两张芯片的看家基因中, 包括同一基因的上、中、下游的片段, 芯片读数具有一致性, 高表达的均高, 低表达的均低. 说明该芯片的技术以及本次检测的技术和结果均是可靠的, 假阳性率是非常低的, 同时也说明整个实验的各环节, 包括RNA的抽提、cDNA的转录等方法均是成功的. 在DEN诱发大鼠肝癌所表达大于正常肝脏5倍的509个基因中, 325个基因是EST未知基因片段, 占63%！而且这些EST片段中的大部分无论是从芯片的绝对读数, 还是从相对比值上, 都比国内外研究肝癌所涉及的已知基因变化更为明显. 这揭示了肝癌基础研究的广阔未知领域. 变化最为明显的168个已知基因中有68个(占40%)是国内外研究肿瘤中所未涉及的, 在肿瘤有关基因中所涉及到肝癌数目更少. 这进一步表明, 肿瘤(尤其是肝癌)的基础研究尚有广阔的未知领域, 而借助大通量的基因芯片技术检测, 得以充分展现出那些变化显著的基因, 这对于今后有重点和有选择性的研究是十分必要和有帮助的. 基因芯片的结果分析方法有很多, 基因读数比值排序分析法未必是最好的, 但是是行之有效的方法. 通过对这种方法整理出的基因结果分析, 我们发现比值越大、排序越靠前的基因, 其于肿瘤和肝癌的关系越明显, 并且一些基因是人类在肿瘤的发生中认识比较早和研究比较多的基因, 例如比值最高的前两个基因p16Ink4a, IGF2. 因此, 我们对以上168个基因中比值最高、肝癌中上调最显著的前30个基因进行文献检索, 总结分类. 我们的研究还表明, 在这些上调的基因中, 清热、健脾、活血和3者组方等不同的中医处方、西药喃氟啶具有选择性的调节作用(另文报道), 而有些基因则不受调控. 提示其中一些基因可能是这些治疗方法的靶基因, 而那些不能被调节者, 一旦今后研究证实是肝癌发生发展的关键基因, 可以用于中西药新药筛选的参考基因.

电编: 张敏 编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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