姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜内NF-κB及TNF-α表达的影响

摘要

目的: 观察姜黄素对小鼠溃疡性结肠炎的抗炎效果, 探讨其作用机制.

方法: 选Balb/c小鼠40只, 随机平均分为4组. A组乙醇灌肠为阴性组, D组噁唑酮(OXZ)灌肠为阳性组, C组在D组基础上按20 mg/kg的姜黄素处理, B组在D组基础上按40 mg/kg的姜黄素处理, 3 d后进行炎症活动指数(DAI)、大体形态损伤、肠黏膜髓过氧化物酶(MPO)活性及组织学改变评分, 再用免疫组化S-P法检测组织标本NF-κB、TNF-α的表达并评分.

结果: A组DAI、大体形态、组织学损伤、MPO、NF-κB、TNF-α的评分依次是0.9±0.74、1.6±0.52、4.1±1.10、0.8±0.63、1.2±0.65、1.3±0.48; B组4.5±0.85、3.3±0.67、14.2±1.40、1.5±0.71、2.8±0.79、2.6±0.70; C组5.9±0.99、4.2±0.63、15.3±1.64、1.7±0.67、3.7±0.95、3.9±0.88; D组10.5±0.97、6.8±0.79、21.3±1.49、3.7±0.95、7.6±1.43、8.1±1.97. 经姜黄素处理的炎症小鼠炎症结肠肠黏膜内NF-κB和TNF-α表达显著下降(P<0.01), 提示其结肠炎症明显减轻. NF-κB与TNF-α的表达显著相关(r = 0.998, P<0.01).

结论: 姜黄素是治疗溃疡性结肠炎的一种有效药物, 其机制可能是通过抑制NF-κB的激活和TNF-α的表达而达到抗炎效果的.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 9, 2004
Revised: November 21, 2004
Accepted: November 25, 2004
Published online: January 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的病因与发病机制目前尚未完全明了, 但有研究证实细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-1β等在其发生和发展中起到重要作用, 他们能够诱导或激活多种炎症细胞和致炎因子, 引起肠黏膜的炎症反应, 而这些细胞因子的表达受到核因子-κВ(NF-κB)的调控. 在本病治疗上也在从抑制NF-κB和某些细胞因子上寻求突破. 我们用姜黄素处理溃疡性结肠炎小鼠模型, 通过观察NF-κB激活和TNF-α的表达情况, 来探讨姜黄素是否通过抑制NF-κB的激活和TNF-α的表达而达到抗炎效果的.

1 材料和方法

1.1 材料

健康Balb/c小鼠40只, 雌雄各半, 6-8周龄, 体重20-25 g, 由武汉大学医学院实验动物中心提供和饲养. 姜黄素和噁唑酮(OXZ)购自Sigma公司; 羊抗小鼠NF-κBp65多克隆抗体、羊抗小鼠TNF-α多克隆抗体、S-P试剂盒和联苯胺检测试剂盒均购自北京中山试剂公司.

1.2 方法

1.2.1 溃疡性结肠炎小鼠模型的制作: 用噁唑酮法诱导小鼠溃疡性结肠炎, 将小鼠用乙醚麻醉, 经肛门插入一细导管, 距肛缘4 cm, 缓缓注入OXZ溶液150 μL(6 mg, 溶于500 mL/L乙醇150 μL), 再将小鼠尾巴提起倒置约30 s[1].

1.2.2 动物分组: A组用500 mL/L乙醇灌肠后不作处理; B组经噁唑酮诱导成功后, 第2 d腹腔注射姜黄素溶液(0.8 mg, 溶于25 mL/L乙醇1000 μL)一次, 剂量为40 mg/kg-1; C组诱导成功后第二日腹腔注射姜黄素溶液(0.4 mg, 溶于25 mL/L乙醇1000 μL)一次, 剂量为20 mg/kg; D组诱导成功后不作处理.

1.2.3 结肠炎症的评价: 在3 d后进行炎症活动指数(DAI)评分[2], 而后处死小鼠取病变结肠进行大体形态损伤、组织学损伤评分及MPO活性测定. DAI评分见表1, DAI = (体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3; 正常大便成干而小粒状, 半稀便为糊状但不粘肛门, 稀便为液状而且粘肛门, 大便隐血用联苯胺法检测; 大体形态损伤按Luk et al标准(表2)[3]; 组织学损伤按韩英et al[4]标准; MPO活性测定方法为取小鼠结肠组织200 mg加2 g/L十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)1 mL, 以邻联茴香胺为底物, 用UV-200型紫外分光光度计于波长655 nm处测定5 min内吸光度(A)变化均值, 每分钟A值变化1.0为1个酶活性单位.

表1 DAI评分标准.

记分	体重下降(%)	大便性状	便血
0	无	正常	阴性
1	1-5
2	6-10	半稀便	隐血
3	11-15
4	>15	稀便	肉眼血便

表2 大体形态评分标准.

记分	病理改变
0	无损伤
1	充血但没有溃疡
2	充血而且肠壁变厚但没有溃疡
3	有一处溃疡但没有肠壁的增厚
4	有两处或两处以上的溃疡/炎症
5	有两处或两处以上的大溃疡和炎症或者有一处溃疡/炎症沿结肠纵轴超过1 cm
6-10	沿结肠纵轴的损伤超过2 cm以上每超过1 cm增加1分

1.2.4 NF-κB、TNF-α表达的检测及评分 用免疫组化S-P法检测, 组织切片脱蜡; 将玻片置柠檬酸缓冲液中用医用微波炉进行抗原修复, 水洗; 滴加30 mL/L的H₂O₂室温10 min阻断内源性过氧化物酶, PBS液冲洗; 正常血清在室温下封闭15 min, 清除多余血清; 滴加羊抗小鼠NF-κBP65多克隆抗体37 ℃孵育1 h, PBS冲液洗; 滴加生物素化的兔抗羊IG抗体室温孵育15 min, PBS冲液洗; 滴加过氧化物酶标记的链酶亲和素室温孵育15 min, PBS液冲洗; DAB显色2-5 min, 苏木素复染后, 封片观察. TNF-α的检测用羊抗小鼠TNF-α多克隆抗体替代羊抗小鼠NF-κB P65多克隆抗体即可. 免疫组化的切片在电镜下进行评分, A组小鼠作阴性对照, 已知阳性片作阳性对照. 采用统一的染色积分评价标准: 染色强度分4级, 阴性染色0分; 弱阳性染色1分; 中度阳性染色2分; 强阳性染色3分. 每张切片按所见阳性细胞范围分5级, 阴性0分; 阳性细胞占1-25%的1分; 阳性细胞占26-50%的2分; 阳性细胞占51-75%的3分; 阳性细胞占76-100%的4分. 每张切片的评分为二者的乘积.

统计学处理 评分以平均数±标准差(mean±SD)表示. 用2.0版SPSS软件对正态分布的数据进行t检验, 采用Spearman法作等级相关分析.

2 结果

2.1 DAI评分

小鼠在灌肠苏醒后A组基本活动如常, B、C、D组逐渐出现懒动、拱背、厌食、体重下降、大便次数增多, 主要为稀便和脓血便. 但B、C组症状明显轻于D组. 评分示B、C组与D组比较差异有显著性(P<0.01), 说明姜黄素对噁唑酮诱导的结肠炎症具有治疗作用. 各组评分见表3.

表3 各项评分(mean±SD).

	DAI评分	大体形态损伤评分	组织学损伤评分	MPO值(U/g)	NF-κB激活评分	TNF-α表达评分
A	0.9±0.74bd	1.6±0.52bd	4.1±1.10bd	0.8±0.63bd	1.2±0.65bd	1.3±0.48bd
B	4.5±0.85ad	3.3±0.67bd	14.2±1.40ad	1.5±0.71b	2.8±0.79ad	2.6±0.70bd
C	5.9±0.99b	4.2±0.63d	15.3±1.64b	1.7±0.67b	3.7±0.95d	3.9±0.88b
D	10.5±0.97	6.8±0.79	21.3±1.49	3.7±0.95	7.6±1.43	8.1±1.97

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs C组;

^dP<0.01 vs D组.

2.2 大体形态与组织损伤评分

噁唑酮诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型病变主要在近肛门段结肠, 可见结肠黏膜充血水肿、糜烂及溃疡形成, 部分肠段肠壁增厚. 以D组病变最严重, 呈连续性分布, B、C组病变明显减轻. 将病变组织切片经HE染色后, 镜下可见结肠黏膜溃疡及伪膜形成; 隐窝和黏蛋白减少或消失; 淋巴细胞和中性粒细胞浸润; 部分小鼠肠段还有纤维化形成. D组尤为严重, 浸润深度可达固有层或以下, 而B、C组病变主要在黏膜层. 评分示B、C组与D组比较差异有显著性(P<0.01), B组与C组比较也存在差异性(P<0.05). 可见姜黄素减轻结肠炎症可能存在剂量依赖性. 各组评分(表3).

2.3 MPO活性测定

经姜黄素处理的小鼠MPO活性值明显下降, 评分示B、C组与D组比较有显著性差异(P<0.01), 说明姜黄素可抑制溃疡性结肠炎的结肠炎症发展. 各组评分(表3).

2.4 NF-κB的表达主要位于表面上皮、隐窝上皮细胞和巨噬细胞

A组在胞质中偶有表达, B、C组胞质中多呈棕黄色而胞核中为淡黄色, D组胞质多为深棕黄色. TNF-α表达多位于巨噬细胞、淋巴细胞的胞质, 呈黄褐色, D组胞质的颜色明显深于B、C组. 评分示B、C组与D组比较差异有显著性(P<0.01), B组与C组比较也存在差异性(P<0.05), 用Spearman等级相关法分析可见TNF-α与NF-κB表达显著相关(r = 0.998 P<0.01), 各组评分(表3).

3 讨论

噁唑酮诱导成功的小鼠病变位于近肛门段大肠, 炎症局限在黏膜及黏膜下层, 表现为充血水肿、糜烂及溃疡, 镜下可见单核巨噬细胞浸润等. 在病理学和免疫学特征上均类似活动期UC患者.

UC的发病是多因素、多机制作用的结果[5], 其中免疫因素是主要因素之一, 而免疫因素中的细胞因子在UC的发生、发展中扮演着重要角色. 常见的有IL-1β、IL-2、IL-4、IFN、TNF-α等, 我们的研究显示UC小鼠的肠黏膜TNF-α的表达明显增加. TNF-α生物活性广泛, 他与细胞表面的TNF受体结合表现多种生物学功能而促进炎症的发生、发展, 主要表现在: (1)激活中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞增强其吞噬功能, 本身释放的同时刺激细胞因子的释放如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFN, 还通过刺激趋化蛋白-1(MCP-1)的合成及分泌而激活单核细胞等并诱导其趋化; (2)刺激黏附分子的表达如细胞内黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、内皮细胞黏附分子-1(ELAM-1)[6], 介导炎症细胞的黏附; (3)增强T细胞、B细胞对抗原和丝裂原刺激的增生反应. 最重要的是TNF-α可激活NF-κB. TNF-α通过激活IKKs(IκBs激酶)上游的激酶, 主要有NF-κB诱导激酶(NIK)和丝裂原蛋白激酶的激酶-1(MEKK1), 他们分别使IKK1和IKK2磷酸化而将他们激活, 后二者使IκBs(NF-κB抑制蛋白)磷酸化, 进而泛素化, 最后被26S蛋白酶降解, 从而使NF-κB的抑制解除[7], 其DNA结合位点和核定位信号暴露, NF-κB移位到核内与相应位点结合, 促进多种促炎分子的转录, 主要有: (1)细胞因子如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN等, 已证实TNF-α启动子区有3个NF-κB结合位点, IL-6、IL-8各有一个[8]; (2)趋化蛋白如MCP-1, 已证实MCP-1基因启动子部位含有结合NF-κB的一个基因片段; (3)黏附分子如ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1、P选择素、E选择素等, 各黏附分子的增强子区均有NF-κB结合位点; (4)诱生型酶如COX-2、iNOS等[9]; (5)免疫性受体如MHC-I、MHC-Ⅱ、TCRα、TCRβ、Igκ轻链等. NF-κB和TNF-α相互促进, 形成推进炎症发展的放大效应.

目前UC治疗主要集中在抑制机体免疫反应上, 这类药物疗效尚可, 但副作用较大, 不利于长期应用. 姜黄素作为中成药毒副作用低, 已有研究证实他有抗炎作用, 且本次研究显示他确有显著的抗炎疗效, 经姜黄素作用的小鼠病变结肠黏膜内TNF-α的表达明显降低, 这与Marion et al研究的结果一致[10]. 姜黄素对TNF-α表达的抑制可能有以下两点: (1)抑制促进TNF-α转录的NF-κB、AP-1的活性, 从而减少TNF-α基因的转录[11]; (2)抑制TNF-α的活化信号途径中一系列的激酶和效应分子, 如蛋白激酶C(PKC)、Jun蛋白N端激酶(JNK)、Src激酶、MEKK-1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、G蛋白和花生四烯酸等. 有研究表明姜黄素通过与这些酶竞争结合位点而达到抑制这些激酶目的[12]. 另外, 经姜黄素作用的病变小鼠结肠黏膜内NF-κB的激活也显著降低, 符合Paul et al的研究结果, 姜黄素可能从多阶段抑制NF-κB的激活[13].首先, 抑制NF-κB的部分激活信号或降低信号效应, 如细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-8等)、脂多糖(LPS)、佛波脂(PMA)及凝血酶等. 其次, 抑制NF-κB活化途径中的一些关键酶如PKC、JNK、Src激酶等[14]. 然后, 在IκBs磷酸化及NF-κB向核内移位级联反应过程中, 姜黄素可抑制MEKK-1、NIK阻止IKKs的磷酸化, 并可直接与IKKs复合物结合抑制其活性[15], 还可直接改变NF-κB亚单位N端的Rel同源域(RDH), 抑制其移位并暴露RDH的IκBs结合残端, 使NF-κB易与IκBs结合从而被阻止活化. 此外, 姜黄素还可抑制促进NF-κB转录的Egr-1基因的表达[16].

总之, TNF-α和NF-κB在炎症的发生、发展过程中扮演的重要角色. 姜黄素很可能是通过抑制TNF-α表达和NF-κB激活, 阻断炎症的放大效应而达到显著的抗炎效果, 从而可能成为治疗UC的一种有效药物.

备注

编辑: 张海宁

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