蛋白质组学技术在幽门螺杆菌研究中的应用

摘要

蛋白质组学是旨在研究蛋白质表达谱和蛋白质与蛋白质之间相互作用的新领域. 他的研究以双向电泳和质谱技术为核心. 其技术为幽门螺杆菌基本生物学特性研究, 探讨致病机制, 寻找保护抗原与研究免疫机制等提供了新的思路和方法.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 23, 2004
Revised: November 29, 2004
Accepted: December 9, 2004
Published online: January 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因, 与胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴样组织恶性淋巴瘤的发生亦密切相关[1], 世界卫生组织(WHO)已将其列为一类致癌因子[2]. 随着对H. pylori生物特性、致病机制以及疫苗等的研究日趋深入, 积极地应用当前不断涌现的新策略与新技术, 将使H. pylori的研究更为高效与系统. 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新领域, 可分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学, 旨在研究特定条件下细胞内的蛋白质表达谱, 以及每一种蛋白质的表达水平; 描绘蛋白质在亚细胞水平的分布和空间结构特征; 阐明蛋白质与蛋白质之间的相互作用问题. 蛋白质组学最基本的技术是蛋白质的分离和鉴定, 目前主要包括有双向电泳(2-DE)技术[3]、质谱分析技术[4-5]与生物信息学技术. 随着双向电泳技术及各种质谱技术的完善以及生物信息学的发展, 蛋白质组学技术已在生命科学诸多领域得到应用. 现就蛋白质组学相关技术在幽门螺杆菌研究中的应用综述如下.

1 在H. pylori基本生物特性研究中的应用

1983年Warren et al首次发现H. pylori后, 人们就对其生物特性进行了不断地研究, 以期阐明其适应胃微环境生长的特殊生理机制、生化代谢途径、基因调控机制及与宿主相互作用过程等. 在H. pylori的感染过程中定植是关键, H. pylori既可以暂时性地暴露在低pH值的胃酸环境中, 也能够长期地定植在胃表皮细胞周围的中性pH值的微环境下. Slonczewski et al[6]利用2-DE和蛋白质N端测序技术对此进行了研究. 通过对在pH值5.7和pH值7.5下培养的H. pylori的2-DE结果比较, 发现在不同pH值下UreB和HspA始终是H. pylori表达最多的蛋白. 虽然UreB的表达并非是如前人所述的组成性表达, 但是其表达却和pH值的变化存在相关性. 另外还在低pH值培养的H. pylori中发现哺乳动物脂蛋白A-I, 这意味着H. pylori很有可能利用吸收宿主高密度脂蛋白以利于自身糖脂膜的形成.

在延长培养时间或暴露于大气时, 典型的H. pylori会发生球体样的形态变化. 这种球型体有两种类型, 一种较大, 可能是一种退化型, 在传代中不能再生长, 另一种是小圆球体, 在透射电镜下可见其细胞电子密度较高, 且具有完整的细胞膜. 他已经被证明至少在30 d内对物理和化学因素有一定的耐受性, 且在4-6 wk内在适合的条件下能重新生长和繁殖. 认识H. pylori在不利环境下形态的变化, 或许对了解某些治疗H. pylori失败的原因有积极作用. 贾继辉et al[7]在研究H. pylori由螺杆状转变成球形休眠体的相关蛋白时, 就运用双向电泳技术比较螺杆状H. pylori及其球形休眠体全菌蛋白表达谱, 之后将差异蛋白进行胶内酶切, 将肽混合物用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析, 将肽质量指纹谱数据输入Mascot数据库(http://www.matrixscience.com)和Peptident数据库(http://www.expasy.ch/tools/peptident.htm)进行检索. 结果获得9个与H. pylori球形休眠体形成相关的蛋白, 即相对分子质量(M_r)为26×10³的过氧化物酶、硫氧还蛋白、烯醇酶、黄素氧化还原蛋白、单链DNA结合蛋白、翻译起始因子1、延长因子P、中性粒细胞激活蛋白和M_r为10×10³的热休克蛋白. 该项研究为幽门螺杆菌球形休眠体形成机制的研究提供新的实验依据.

此外, McAtee et al[8]在对H. pylori对甲硝唑(MTZ)的耐药性研究中, 应用2-DE和质谱分析, 发现了和H. pylori耐受MTZ相关的蛋白AHP. Govorun et al[9]亦应用2-DE和MALDI-MS对俄罗斯不同地区进行了H. pylori菌株分型的基础实验. 蛋白质组学技术已为H. pylori的基本生物学研究提供了快速而有效的手段[10-11].

2 在H. pylori致病机制研究中的应用

在全世界范围内H. pylori在人群中的定植率高达50%-60%[12], 且现已明确H. pylori与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和黏膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等消化道疾病密切相关. 在分子层面人们也认识了和H. pylori致病相关的尿素酶复合物, 引发一系列宿主机体病变的Cag致病岛和诱发空泡产生的空泡毒素等蛋白, 但是在H. pylori对宿主黏膜的侵袭, 对炎症细胞的激活及其致癌机制上仍有很多具体问题还困扰着人们. 蛋白质组学技术及其策略有可能会为我们打开另外一扇窗户.

Kimmel et al[13]用幽门螺杆菌G27的全菌裂解液进行2-DE, 之后用16例H. pylori阳性患者(其中慢性胃炎患者6例, 消化性胃溃疡5例, 胃癌4例, MALT淋巴癌1例)血清, 5名H. pylori阴性健康志愿者的血清逐个进行免疫印迹实验. 对比后发现一共有29个和以上疾病相关的蛋白斑点. 对其逐个进行质谱分析, 确定他们在H. pylori中所对应的蛋白后, 选出20个免疫反应明显的蛋白进行比较, 发现鞭毛蛋白A(HP0601)是唯一个在所有16个病例的免疫反应中均呈阳性的蛋白, 而鞭毛钩状相关蛋白(HP0752)及分子伴侣GroEL(HP0010)和14个病例的血清产生反应. 此外, UreB(HP0752), 嗜中性粒细胞激活因子(HP0243), 过氧化氢还原酶(HP1563), 铁氧化还原蛋白还原酶(HP1110), EF-Tu(HP1205), 核糖体蛋白L7/L12(HP1199), Omp18(HP1125)以及DnaK蛋白(HP0109)和超过2/3病例的阳性血清有反应. 然而值得注意的是FlaA, UreB, GroEL, EF-Tu和核糖体蛋白L7/L12以及Omp18在H. pylori阴性的血清中也有低频的免疫反应. 对这些蛋白功能的进一步研究将有望推动人们对H. pylori致病机制的认识.

在国内, 李波清et al[14]在寻找H. pylori与胃癌相关蛋白的研究中, 利用2-DE分离H. pylori的全菌蛋白, 应用ImageMaster 2 D v3.11软件对3株分离自胃癌患者的H. pylori菌株、1株胃癌动物模型菌株及9株分离自非胃癌患者的H. pylori菌株的蛋白图谱进行比较, 对目的蛋白进行基质辅助激光解析及电离飞行时间质谱分析, 应用Mascot软件进行蛋白搜库, 结果发现3种蛋白可能与胃癌相关, 经肽指纹图谱鉴定, 一种为酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶, 另两种蛋白在现有的质谱库中无明确匹配蛋白存在. 从而提出酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶可能是与胃癌相关的H. pylori特异蛋白, 而另两种为新发现的可能与胃癌相关的H. pylori特异蛋白, 其相关机制尚待进一步阐明.

3 在H. pylori保护性抗原研究中的应用

虽然全菌粗制抗原制成疫苗一直用于疫苗开发与生产, 而且也有研究者使用H. pylori全菌裂解液免疫动物后获得了良好的效果, 但使用全菌粗制抗原存在因交叉反应引起的一系列不良反应等问题, 且H. pylori是对营养要求较高的微需氧菌, 生长周期长、产量低、易污染、菌种保存不易, 因而以H. pylori全菌制备传统的菌苗几乎无可行性.

大多学者认为, 发展基因工程疫苗是较为合理的研发方向, 目前已发现的H. pylori抗原虽不下数十种, 但有实验基础并较为认可的保护性抗原并不多, 主要有尿素酶、空泡毒素、某些黏附素、鞭毛蛋白等. 在H. pylori编码的一千多个蛋白中还可能存在着其他与H. pylori的生存和致病性关系更为密切的蛋白. 这些未知功能的蛋白, 一直还在吸引着研究者不断探索, 蛋白质组学技术及策略也适用于对H. pylori保护性抗原的高通量筛选.

在疫苗的开发研究中, 对分泌型蛋白的全面深入地了解有着重要意义. 然而由于目前H. pylori的培养大多还需要添加外来血清, 在无血清培养中存在H. pylori自溶的现象, 这为H. pylori分泌型蛋白的研究带来很大困难. Bumann et al[15]在研究中, 通过优化培养条件, 在基础培养基中完成HP26695, J99的培养, 并获得胞外蛋白, 之后将其进行2-DE和肽指纹图谱鉴定, 与全细胞2-DE结果比对后发现33个胞外蛋白, 其中有26个为已知蛋白, 包括氧化还原蛋白, 鞭毛蛋白, VacA的三个已知的片段, 丝氨酸蛋白酶HtrA, 另外还有8种未知功能蛋白(HP0906, HP0367, HP0175, HP0231, HP1098, HP1173, HP0231, HP1454). 这是在H. pylori研究中首次应用蛋白质组学技术对其分泌型蛋白进行全面分析, 该研究为阻断H. pylori对宿主地侵噬和寻找潜在保护性抗原提供了新的思路和实验依据.

寻找具有良好免疫原性、氨基酸序列保守的膜蛋白, 对于疫苗的研究也有着重要意义. Baik et al[16]在研究中应用HP26695作为研究对象, 分离得到肌氨酸所不溶的膜蛋白后, 进行2-DE后得到80个蛋白斑点, 进行质谱分析和数据库对比后找到可能对应的35个膜蛋白基因. 之后再用300例H. pylori阳性患者血清和13名H. pylori阴性志愿者血清进行免疫印迹实验, 发现9个和阳性血清反应但未和阴性对照反应的H. pylori膜蛋白, 其中未知蛋白(HP1173), FabZ(HP1376), Omp11(HP0472)Omp14(HP0671)和Omp21(HP0913)尚未见相关报道. 这为H. pylori膜蛋白的研究和保护性抗原的寻找提供了有力的实验依据.

另外, Jungblut et al[17]对H. pylori全细胞裂解物进行2-DE分离后进行质谱分析鉴定出152个蛋白, 是目前对H. pylori蛋白质组较为全面的分析, 其2-DE图谱可在http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE/获得. 相信随着实验数据的快速丰富和更为有效的数据分析方法的提出, 对H. pylori保护性抗原的寻找与筛选效率将得到实质性的提升.

总之蛋白质组学技术被引入H. pylori的研究以来, 已将H. pylori的生物特性、致病机制、疫苗开发等研究带入了全面系统的层面. 但由于各种条件限制, 目前的研究还着重于应用表达蛋白质组学技术对不同生理病理状况下的H. pylori的表达进行分析与比较, 相信随着方法与技术的不断创新与发展, 蛋白质组学技术特别是功能蛋白质组学技术将在H. pylori的诊断与治疗、H. pylori与相关致病机制研究、H. pylori疫苗的开发等领域发挥独特的不可替代的作用.

备注

编辑: 张海宁

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