基于蛋白优势表位的乙型肝炎疫苗研究

摘要

乙型肝炎是中国的常见病. 本文对基于乙肝病毒抗原表位的多肽疫苗研究和基于乙肝病毒表面抗原的转基因植物技术的研究进展和存在的问题进行了分析. 并就可能诱导黏膜B、T细胞免疫的基于乙肝病毒抗原优势表位多肽的转基因植物口服疫苗的研究进行了预测和展望.

关键词: 乙型肝炎; 疫苗; 表位

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 22, 2004
Revised: December 31, 2004
Accepted: January 10, 2005
Published online: January 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎是严重危害人类健康的常见病. 全球乙肝病毒感染者约占人群的30%. 中国属高流行区, 乙肝病毒携带者约占人口的10%, 慢性肝炎患者近3000万, 是我国的主要卫生问题之一, 如感染迁延不愈, 可能发展为肝硬化、肝癌. 据估计全球每年至少有50万乙肝患者死于肝硬化和肝癌. 目前, 控制乙型肝炎流行的主要手段是由WHO推行的全球免疫接种计划(EPI). 但该计划依赖的预防性疫苗, 对已感染者无效, 而且在未感染人群中, 有5-15%不应答, 接种普及率仍不够高. 在今后相当长的时期内, 乙肝仍将是重要健康问题之一. 基于乙肝病毒抗原表位的治疗性多肽疫苗研究和安全、高效、价廉、易于普及推广, 且能够诱导黏膜B、T细胞免疫的乙型肝炎口服疫苗正成为乙型肝炎预防和治疗的研究热点.

1 基于乙肝病毒抗原优势表位的多肽疫苗研究

近年来, 人们采用DNA疫苗、重组蛋白疫苗、免疫复合物疫苗、多肽疫苗等技术对乙型肝炎的防治进行了探索, 其中有些已经进入临床试验. 但采用天然抗原所带来的问题, (即蛋白质抗原并非通过其完整分子发挥功能, 而是通过其表位体现其特异性), 仍未得到克服. 目前国内外研究采用天然抗原的免疫治疗效果, 均不很理想. 现在基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留在病原体或天然抗原整体分子水平, 而是基于其表位特异性. 就某一蛋白质抗原而言, 他不仅含有B、TH、CTL、NK等细胞表位和MHC限制位等与免疫识别密切相关的结构, 同时还含有毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理与自身抗原交叉反应性表位等, 他们可引起对机体不利的免疫反应而导致免疫耐受. 天然HBV抗原正由于含有一些不合理的表位组分, 可引起TH1/TH2失平衡、免疫偏差或免疫缺陷; 同时天然HBV抗原含有某些保守基团, 可干扰细胞间信号、诱导免疫颠覆. 病毒因此可逃避机体的免疫清除而长期存在于肝细胞内, 加重肝脏病理和肝损害[1-5]. 因此, 新一代疫苗应该摒除前述不合理成分, 在保持HBV抗原特异性的基础上, 诱导与天然感染过程有所不同的免疫应答. 由于许多天然抗原引发的免疫反应不能满足预防感染或预防发病的需要, 因此为提高蛋白质抗原的保护性, 就必须在表位水平上做出选择, 摒除后者, 保留、改善前者以得到更理想的疫苗分子. 现代保护性免疫理论认为, 有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配[6-7]. 这对设计新一代高效、高特异性的疫苗或免疫制剂具有重要意义, 也使采用分子设计的理论和方法改进免疫原成为可能.

随着免疫原由病原体向蛋白质、表位肽过渡, 其分子质量逐渐变小, 所诱发的免疫应答针对性增强, 并摆脱了抑制性表位和致病性表位的影响, 但抗原性和免疫原性也呈现依次降低的规律, 从而使得许多重组蛋白或小分子疫苗不能在体激发有效的免疫应答. 因此, 必须对所设计多肽进行人工化学修饰(如糖基化、磷酸化、脂化等)以满足抗原呈递的要求, 但其操作非常复杂、效率较低, 且对环境影响大、成本高, 而且还必需考虑修饰方式对表位间相对位置、构象特征、表位侧翼顺序的影响, 否则极易造成多肽失活. 这已成为目前分子疫苗研究中的难点之一.

2 基于乙肝病毒表面抗原的转基因植物技术研究

Mason et al[8-9]于1992年提出了亚单位转基因植物疫苗的概念, 并将乙肝病毒表面抗原基因转入烟草中表达. 植物载体表达系统使口服免疫策略变得简单易行. 且研究表明植物表达物能在动物体内诱导B、T细胞免疫反应. 随着对植物转基因表达和蛋白重组知识的积累, 应用可食用植物作为亚单位抗乙型肝炎疫苗的表达和转运系统的研究逐渐被重视并不断取得新的进展. 迄今人们已经成功地将细菌性和病毒性病原体抗原的编码基因导入植物基因组, 表达物较好地保留了天然抗原的免疫原性[10-17]. 利用转基因植物生产疫苗已获成功的有10多种, 如乙肝病毒表面蛋白、狂犬病毒表面蛋白、霍乱病毒表面蛋白及诺沃克病毒表面蛋白等. 这些研究选用的植物主要是烟草、马铃薯、番茄、香蕉、莴苣等. 其中番茄、香蕉是人们喜爱的食物, 可以生食而不会破坏疫苗蛋白. 因此, 1995年以来以番茄、香蕉生产口服疫苗的研究较多. 狂犬病毒糖蛋白、天花病毒表面抗原均在番茄中得到成功表达.

HBV包膜蛋白含三个糖蛋白(小蛋白含S抗原, 中蛋白含Pre-S2+S, 大蛋白含Pre-S1+Pre-S2+S), 每个都可诱导有效的抗病毒中和抗体产生和保护性免疫应答. 一直以来, 在研究工作中和商用乙型肝炎疫苗中, 多是应用Pre-S1和Pre-S2, 以产生有效的抗HBV体液免疫应答. 目前, 国际上口服重组HBsAg转基因植物技术的研究也多是基于此, 并在体外体内实验中诱导产生了高滴度特异性抗体[13-18].

转基因植物技术的发展, 也为解决多肽疫苗研究的难题提供了一种有效途径. 与传统的疫苗表达系统相比, 植物表达系统生产疫苗有以下优点: (1)可对蛋白质抗原进行正确加工, 进行自然状态下的糖基化、磷酸化、酰胺化等修饰; (2)植物细胞壁给抗原提供了一种生物微囊, 可保护抗原不被消化酶降解, 发挥缓释作用, 提高所表达抗原的免疫原性, 而且还能启动黏膜免疫; (3)价廉易再生性: 植物的组织(如叶、花、果实等)、细胞、原生质体均能在离体条件下诱导再生成一个完整的植株, 而且一旦获得高效表达的转基因植株, 就可以在短时间内大量繁殖出有相同遗传背景的无性繁殖系, 只需增加耕种面积, 就能迅速形成产业化规模, 成本较低; (4)不会感染人体, 具有安全性.

3 基于乙肝病毒抗原优势表位的转基因植物口服疫苗研究展望

近年来, 嗜肝病毒家族成员的相对进化关系、病毒抗原的表位数据库均已明确和建立. 在乙肝病毒抗原B、T细胞表位预测的基础上, 有研究提出了用模拟抗原(mimogen)进行特异性免疫的思路. 模拟抗原在抗原特性上与天然抗原不同, 而引起的免疫反应特异性与天然抗原无异. 他摒除了致病性表位、优势非保护性表位、亚优势保护性表位、交叉反应性表位等不利组分, 具有更好的针对性[19-21].

我们知道, 多数人类病原体通过黏膜表面入侵宿主. 疫苗中的抗原多是通过黏膜淋巴组织摄取而诱导机体产生有效的保护性黏膜免疫应答. 这些淋巴组织被M细胞(特殊的上皮细胞)包围, 由M细胞负责抗原的"取样", 决定向黏膜B、T细胞提呈何种抗原[22-23]. 近年研究发现, 在疫苗设计中加入细胞因子或趋化因子作为生物佐剂可帮助抗原靶向到抗原提呈细胞(APC), 诱导APC的成熟, 促使细胞表达多种趋化因子受体, 引导细胞免疫反应向TH1型和CD8+CTL应答转化, 同时诱导全身性IgG和黏膜IgA应答, 辅助诱导CTL应答, 并诱导有效的免疫记忆[24].

基于前述的研究成果和进展, 我们预测, 通过基因重组技术, 将所获得的模拟肽抗原基因和靶向蛋白基因及合适的细胞因子基因分别构建到植物表达载体中, 根据转基因植物中的单拷贝外源基因遵循孟德尔遗传规律的特点, 进行转基因植株的有性杂交, 获得同时含有靶向蛋白、模拟抗原肽和细胞因子的转基因植株, 以诱导保护性黏膜免疫和CTL应答, 将有可能为安全、有效、价廉且易于普及推广的乙型肝炎口服疫苗的研制奠定实验基础.

备注

编辑: 张海宁

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