奥沙拉秦钠对溃疡性结肠炎一氧化氮合酶表达的影响

摘要

目的: 探讨奥沙拉秦钠对溃疡性结肠炎一氧化氮合酶表达的影响.

方法: 收集36例活动期患者结肠黏膜标本, 应用免疫组化方法检测奥沙拉秦钠治疗前后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)及硝基酪氨酸的表达.

结果: 4例患者炎症部位结肠黏膜上皮细胞表达eNOS, 浸润炎症细胞无eNOS表达. 炎症部位黏膜上皮细胞36例(100%)表达iNOS, 其中13例为强阳性, 23例为弱阳性; 1例在腺泡上皮细胞有弱阳性表达; 18例(50%)固有层炎症细胞呈现iNOS阳性. 经奥沙拉秦钠治疗后, 缓解期只有5例患者黏膜上皮细胞表达iNOS, 为弱阳性. 非炎症部位各类细胞均无iNOS表达. 5例患者在炎症部位黏膜上皮细胞中有硝基酪氨酸表达, 其中1例伴腺泡上皮硝基酪氨酸表达, 表达均为弱阳性, 固有层浸润炎症细胞未见表达, 非炎症部位各类细胞均无表达.

结论: 奥沙拉秦钠可抑制iNOS的产生, 减轻炎症, 促进溃疡愈合.

关键词: 溃疡性结肠炎; 奥沙拉秦钠; 一氧化氮合酶

Effects of olsalazine sodium on expression of nitric oxide synthase in patients with ulcerative colitis: an analysis of 36 cases

Jun-Ming Hao, Xue-Liang Jiang, Yan-Ming Tong

Jun-Ming Hao, Yan-Ming Tong, Department of Endoscopy, Beijing Charity Hospital, Rehabilitation College of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100068, China

Xue-Liang Jiang, Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital of Ji nan Military Command Area, Ji nan 250031, Shandong Province, China

Correspondence to: Xue-Liang Jiang, Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital of Ji nan Military Command Area, 25 Shifan Road, Ji nan 250031, Shandong Province, China. jiangxueliang678@126.com

Received: September 21, 2005
Revised: September 25, 2005
Accepted: September 30, 2005
Published online: October 15, 2005

Abstract

AIM: To explore the effects of olsalazine sodium on the expression of nitric oxide synthase (NOS) in patients with ulcerative colitis (UC).

METHODS: The colonic mucosa specimens were collected from 36 patients with active ulcerative colitis. The expression of inducible NOS (iNOS), epithelial NOS(eNOS), and nitrotyrosine were detected by immunohistochemistry before and after the patients were treated with olsalazine sodium.

RESULTS: eNOS was expressed in the mucosal epithelial cells of the inflammatory area in 4 patients, but not expressed in the inflammatory cells. iNOS was expressed in the mucosal epithelial cells of all the 36 (100%) samples (13 strong positive and 23 light positive) taken from inflammatory area. iNOS light positive staining in acinar cells of colonic epithelium was detected in 1 patient only. Inflammatory cells in the lamina propria expressed iNOS in 18 (50%) cases. After the treatment of olsalazine sodium, iNOS was lightly and positively expressed in the mucosal epithelial cells of only 5 patients, and no iNOS was expressed in non-inflammatory areas. Nitrotyrosine was detected in the mucosal epithelial cells of inflammatory areas in 5 patients, of which only 1 was accompanied by light and positive expression of nitrotyrosine in the acinar epithelial cells. No nitrotyrosine expression was found in the inflammatory cells of the lamina propria and non-inflammatory areas.

CONCLUSION: Olsalazine sodium can inhibit the expression of iNOS, alleviate the inflammation, and promote the healing of the ulcer.

Key Words: Ulcerative colitis; Olsalazine sodium; Nitric oxide synthase

0 引言

溃疡性结肠炎(UC)是较常见的消化道疾病, 近年来我国报道的病例数显著增加[1,2]. 文献报道, UC患者结肠内一氧化氮(NO)明显升高[3]. 由于NO是一种带有自由基特性的气体, 具有直接的细胞毒作用, 也可与超氧阴离子反应, 产生过硝酸盐, 通过脂质过氧化物, 蛋白巯基氧化, 芳香氨基酸如酪氨酸硝基化产生硝基酪氨酸的途经损伤组织, 因此, 抑制iNOS的产生可以作为治疗UC的新策略[4]. 奥沙拉秦钠由二分子5-氨基水杨酸经偶氮键相连接而成, 在结肠部位被细菌裂解后成为二分子5-氨基水杨酸而发挥作用, 是一种治疗溃疡性结肠炎的新药[5,6], 但其能否抑制iNOS产生未见报道, 我们应用免疫组化方法研究奥沙拉秦钠治疗前后结肠黏膜NOS和硝基酪氨酸的表达.

1 材料和方法

1.1材料

慢性反复发作型UC患者36例, 均符合2000年成都会议制定的标准, 其中男17例, 女19例, 平均年龄34.2岁, 病程6 mo-5年, 均有不同程度的腹泻、腹痛、脓血便、里急后重等症状. 肠镜检查病变累及乙状结肠以上8例, 乙状结肠以下28例. 病理为糜烂溃疡、隐窝脓肿、非特异性炎症及不典型增生等活动性改变. UC患者给予奥沙拉秦钠胶囊治疗(0.5 g, 2 次/d, 8 wk, 由天津力生制药股份有限公司生产. 畅美^Ò为奥沙拉秦钠的胶囊剂, 每粒250 mg, 批准文号: 国药准字X20000247).

1.2 方法

于同一炎症部位治疗前后取活检标本, 其中9例于无炎症部位取标本作对照. 活检标本置16 g/L甲醛溶液固定, 常规石蜡包埋, 切片, HE染色. 另制作切片行免疫组织化学染色, 主要步骤如下: 石蜡切片经二甲苯脱腊、梯度酒精脱苯后用PBS溶液冲洗. 经过氧化氢处理、PBS冲洗后, 将切片置柠檬酸缓冲液加热至98 ℃ 10 min. 冷却后依次用PBS冲洗、加一抗［鼠抗人eNOS抗体、iNOS抗体或硝基酪氨酸抗体, 均为购自Calbiochem的单克隆抗体^]、冲洗、加EnVision复合物、冲洗、加DAB显色, 最后苏木素复染、封片. 每批实验以PBS作阴性对照, 已知阳性片作阳性对照. 以细胞浆出现棕黄色微细颗粒为阳性, 以Fromowitz半定量法记分, 阳性细胞占同类细胞数<5%为0分; 5-25%为1分; 26-50%为2分; 51-75%为3分; >75%为4分. 胞浆染色阴性为0分; 浅黄色为1分; 棕黄色为2分; 棕褐色为3分. 最后将二个分数相加, 0分为(-), 1-4分为(+), 5-7分为(++).

统计学处理 应用SPSS软件进行χ²检验.

2 结果

2.1 eNOS的表达

只有4例患者结肠黏膜上皮细胞表达eNOS, 其中1例同时伴有腺上皮细胞的表达, 且均为弱阳性. 浸润炎症细胞无eNOS表达.

2.2 iNOS的表达

iNOS主要在炎症部位黏膜上皮细胞中表达, 表达率为100%, 其中13例为强阳性, 23例为弱阳性, 分布较局限, 集中在隐窝的顶部. 1例在腺泡上皮细胞有弱阳性表达. 18例(50%)固有层炎细胞呈现iNOS阳性. 奥沙拉秦钠治疗后, 缓解期只有5例患者黏膜上皮细胞表达iNOS, 为弱阳性. 非炎症部位各类细胞均无iNOS表达(表1).

表1 溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中iNOS的表达.

UC	n	黏膜上皮			腺胞上皮			浸润炎细胞
		++	+	-	++	+	-	++	+	-
治疗前	36	13	23	0	0	1	35	3	16	17
治疗后	36	0	5	31b	0	0	36	1	8	27
非炎症部位	9		0	0		0	0		0	0

^bP<0.01 vs 治疗前.

2.3 硝基酪氨酸的表达

5例患者在炎症部位黏膜上皮细胞中有硝基酪氨酸表达, 其中1例伴腺泡上皮硝基酪氨酸表达, 表达均为弱阳性, 固有层浸润炎症细胞未见表达, 非炎症部位各类细胞均无表达.

3 讨论

NO合成有赖于一氧化氮合酶(NOS)的作用, NOS按其来源分为3种类型: 神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱生型(iNOS). 前两种合称为结构型NOS(cNOS). cNOS是钙离子和钙调蛋白依赖性酶, 存在于机体部分神经元、血管内皮细胞中, 具有稳定的活性, 持续释放少量NO作为神经递质和起局部血流调节作用. iNOS是钙离子和钙调蛋白非依赖性酶, 在正常生理状态下不表达, 但在炎症时表达, 它由细胞因子g-IFN, TNF-α, IL-1和LPS诱导, 而被TGF-β, IL-8和IL-10抑制[4].

Singer et al[7] 报道8例UC患者7例结肠黏膜上皮表达iNOS, 主要集中于表面和隐窝上皮, 4例固有层单核细胞有iNOS表达, 正常黏膜表达阴性. Dijkstra et al[8]报道所有UC患者黏膜上皮表达iNOS, 隐窝顶部表达较强, 少量炎症细胞表达iNOS, 无炎症部位黏膜和正常肠黏膜无iNOS表达. 本研究显示, 100%的UC患者炎症部位肠黏膜上皮细胞表达iNOS, 50%的患者其肠黏膜固有层炎细胞表达iNOS, 而非炎症部位肠黏膜无iNOS表达, 与上述结果基本相同, 与文献报道UC时结肠黏膜iNOS mRNA表达增高一致, 表明UC时上皮细胞过量表达iNOS, 产生大量NO. Lundberg et al[9]也检测到UC患者结肠腔内NO浓度明显增高. 对上皮细胞大量表达iNOS产生的NO的作用意见不一. 有的认为NO可能形成氧屏障抵御细菌入侵, 如应用iNSO抑制剂L-精氨酸加剧醋酸诱导的大鼠结肠炎; 有的认为NO引起腹泻和组织损害, 抑制iNOS产生的药物可以作为治疗UC的新的策略, 可的松在体外可抑制iNOS的产生[4], 这可能也是可的松类药物治疗UC的机制之一.

奥沙拉秦钠在小肠不吸收, 在结肠部位的细菌(氮分解酶)作用下, 偶氮键断裂, 产生两分子5-氨基水杨酸, 发挥治疗作用[5]. 其可能作用机制是: (1)通过抑制环氧化酶途径, 阻断前列腺素的合成; (2)通过抑制脂氧化酶途径, 干扰花生四烯酸代谢, 抑制前列腺素E₂等致炎、致热物质的产生, 使前列腺素E₂浓度下降并恢复正常, 炎症好转或痊愈; (3)抑制巨噬细胞向发炎的黏膜移动, 起到氧自由基清除作用, 减少肠黏膜损伤; 降低溃疡性结肠炎病人肠内白三烯LTB₄浓度和5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)的生成量; (4)抑制血小板活化因子, 抑制结肠脂肪酸氧化, 通过和叶酸竞争抑制内皮细胞增生, 增强机体免疫功能. 但关于其对一氧化氮合酶表达的影响未见报道. 本研究表明, 奥沙拉秦治疗后, 缓解期仅有5例患者黏膜上皮细胞表达iNOS, 并且为弱阳性, 提示奥沙拉秦钠可抑制iNOS的产生, 减轻炎症, 促进溃疡愈合.

Singer et al[7]报道5例中4例上皮细胞有硝基酪氨酸表达, 同样集中于黏膜和隐窝上皮, 且在相同细胞中表达, 但强度不同. Dijkstra et al[8]未发现硝基酪氨酸表达. 本研究显示少数患者炎症部位肠黏膜表达硝基酪氨酸. 这种不一致现象可能与所用的抗体不同有关, 也可能与所选择的患者的病变程度有关.

文献未提及eNOS在结肠上皮细胞中的表达. 本文结果显示, 仅5例患者的结肠黏膜上皮有eNOS表达, 较胃黏膜上皮细胞的表达率低[10], 提示不同部位上皮细胞eNOS的表达率有差异.

备注

电编:李琪 编辑:菅鑫妍 审读:张海宁

参考文献

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