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世界华人消化杂志. 2005-10-15; 13(19): 2349-2354
在线出版日期: 2005-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i19.2349
与胃癌相关的DNA甲基化研究进展
张晔, 袁媛
张晔, 袁媛, 中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所第三研究室 辽宁省沈阳市 110001
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30171054; 国家"十五"科技攻关资助项目, No. 2004BA703BA703B04-02.
通讯作者: 袁媛, 110001, 辽宁省沈阳市, 中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所第三研究室. yyuan@mail.cmu.edu.cn
电话: 024-23256666-6153
收稿日期: 2005-08-29
修回日期: 2005-09-02
接受日期: 2005-09-06
在线出版日期: 2005-10-15

甲基化紊乱与胃癌的发生有关, 近年来甲基化已成为肿瘤研究的热点. DNA甲基化是人类后成论学说的主要复制后修饰方式. 对DNA甲基化的研究发现, 甲基化水平与肿瘤的生物学特性密切相关, 调控增殖、凋亡与分化的基因较多, 其表达多受基因甲基化影响. 因此, 随着技术方法的改进, DNA甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学特性及临床预后的重要指标之一. 我们就与胃癌相关的癌基因、抑癌基因、与凋亡相关基因及DNA错配修复基因的CpG岛甲基化情况作一综述, 说明胃癌的发生与DNA甲基化的关系, 探讨利用基因甲基化的检测作为胃癌早期诊断的生物学标记的可能性.

关键词: 胃癌; DNA甲基化
引文著录: 张晔, 袁媛. 与胃癌相关的DNA甲基化研究进展. 世界华人消化杂志 2005; 13(19): 2349-2354
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: August 29, 2005
Revised: September 2, 2005
Accepted: September 6, 2005
Published online: October 15, 2005

N/A

Key Words: N/A
0 引言

甲基化紊乱与胃癌的发生有关, 近年来甲基化已成为肿瘤研究的热点. DNA甲基化是人类后成论学说的主要复制后修饰方式[1,2]. 它通常发生在胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上. 多种基因的启动子区和第一外显子富含CpG, 而CpG相对集中的区域称为CpG岛. 散在的CpG为甲基化者, 而生理情况下, CpG岛多为非甲基化. DNA甲基化不仅在胚胎发育和细胞分化过程中起着关键作用, 而且在癌变过程中扮演着重要角色. 早期的研究曾强调DNACpG位点异常低甲基化使癌基因得以表达, 从而使细胞恶性转化. 近年来的研究发现在多种人类肿瘤基因组中, 广泛低甲基化和部分区域的高甲基化共存是DNA甲基化水平总的特征. 提示5'端CpG岛甲基化致抑癌基因失活是引起细胞恶性转化的重要步骤[3-9]. 因此DNA甲基化的改变通过影响癌基因和抑癌基因的表达而参与癌的发生. 在肿瘤发生过程中, 甲基化模式发生逆转, 相关基因的甲基化紊乱发生率很高. Costello et al[10-16]曾研究了98种人类主要肿瘤的非选择性的1 184个CpG岛的甲基化状态, 结果癌基因组的4 500个CpG岛中平均600个有甲基化紊乱, 包括早期癌, 并有CpG岛的甲基化特殊肿瘤组织特异性. 近年来, 人们通过对几种癌、癌旁组织和正常组织DNA的分析, 确定某些癌基因(H-Ras、c-Myc)低甲基化和抑癌基因(Rb、p16)的高甲基化改变是细胞癌变的一个重要特征. 同时甲基化状态的改变与基因点突变、基因缺失及基因表达异常的发生有密切关系. DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能的异常, 在真核生物中最重要的甲基化碱基是胞嘧啶, 通常发生在CpG双核苷酸区域. 限制性内切酶HapⅡ和MspⅠ均能识别CCGG, 但是当CCGG序列中某些碱基出现甲基基团修饰时, 则这两种酶识别能力不同, MspⅠ可识别CmCGG, 而HapⅡ则不能. 但这两种酶均不能识别mCmGG结构. 因此, 可利用HapⅡ和MspⅠ酶解情况确定细胞中DNA甲基化状态. 对DNA甲基化的研究发现, 甲基化水平与肿瘤的生物学特性密切相关, 调控增殖、凋亡与分化的基因较多, 其表达多受基因甲基化影响. 因此, 随着技术方法的改进, DNA甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学特性及临床预后的重要指标之一[17-28]. 我们就与胃癌相关的癌基因、抑癌基因、与凋亡相关基因及DNA错配修复基因的CpG岛甲基化情况作一综述, 说明胃癌的发生与DNA甲基化的关系, 探讨利用基因甲基化的检测作为胃癌早期诊断的生物学标记的可能性.

1 与胃癌相关的抑癌基因甲基化

人类很多肿瘤(包括胃肠道肿瘤)是由于细胞增殖与凋亡两者平衡失调所造成的. 任何细胞群体只有增殖而无细胞凋亡或者细胞增殖太快, 凋亡停止或速度太慢, 都将导致细胞群体数量增加. 细胞增殖过程是生长促进因子和生长抑制因子相互调节的结果. 当细胞接受到生长因子提供的信号后, 将进入细胞增殖周期. 细胞周期是由细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶两者之间的相互作用所调控的, 并且从G1到S期的过渡是由细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)所调控, 根据CKI结构特征, 可以分为两个家族: 一是周期素依赖性激酶相互作用蛋白家族, 包括P21WAF1、P27KIP1和P57KIP2等; 另一个为细胞周期素-细胞周期依赖性激酶(CYC-CDK)特异抑制家族,?包括P15INK4B、P16INK4A、P14、P18INK4C和P19INK4D. 细胞凋亡是基因编程控制的死亡, 涉及凋亡过程的基因很多, 按其功能可以分为凋亡诱导基因p53、bax和fas等及凋亡抑制基因bcl-2、survivin和bag-1等. 总之, 调控增殖与凋亡的基因较多, 其表达多受基因甲基化影响. 如前所述, 胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)二核苷酸上的甲基化修饰是脊椎动物基因组最常见的后生遗传修饰方式, 它在基因表达的调控上发挥着重要的作用. 一些癌症相关基因启动子区CpG岛甲基化的紊乱或异常能够导致这些基因的表达沉默. 近几年研究较多的是, 正常时处于静息状态的肿瘤抑制基因显示出高甲基化, 途径有从头合成甲基化(De Nove methylation)和维持甲基化水平增高. 基因启动子区域甲基化是基因表达调控的一种重要机制. 肿瘤抑制基因抑制细胞进入增生周期, 促进细胞成熟, 朝向终末分化或凋亡. 当抑制基因出现异常, 影响其功能的发挥时, 则可能导致肿瘤形成.

1.1 p14、p15和p16基因

它们是细胞周期抑制基因. p14属于INK4a/ARP位点的肿瘤抑制基因. 在胃肠道的肿瘤中, 大多数有相同特点的甲基化谱, 而该基因就属于甲基化谱中一员. 关于p14, 曾认为散发型胃癌中的甲基化率比肠型胃癌更多[29,30]. Esteller et al[23-27,31]应用MSP、RT-PCR, 发现p14启动子的高甲基化出现在约1/4的原发结直肠癌中. p14启动子的高甲基化可看作结直肠癌发生的早期现象, 但它独立于p16甲基化, 与p53突变边缘相关. P14蛋白质能够抑制细胞增殖周期, 主要通过阻止MDM2在核质内流动, 这样通过减弱MDM2介导的降解而稳定p53, 并能够中和由MDM2所抑制的p53的转录活性, 从而终止p53/p21途径所导致的肿瘤细胞无控性增殖[32]. 通过对胃癌细胞株的分析发现[33]: 7个细胞株中有5个不表达该基因mRNA, 对不表达者进一步分析, 发现其启动子高度甲基化. 对胃癌标本分析发现[34], 扩散型胃癌p14启动子甲基化率为45.5%. 另外, p14启动子甲基化而失活者, 在细胞质中可以发现MDM2并且p53表达失活, 用去甲基化试剂处理后, MDM2又回到细胞核而且, p53也表达. 说明该基因的高甲基化是MDM2在细胞核内定位紊乱的关键因素之一[29,30]. 这些结果表明由甲基化所导致的p14基因的沉默在消化系统肿瘤的发生发展中起着一定的作用.

p16是近年来研究的又一热点, 作为CDKIs(cyclin-dependent kinase)家族的重要成员, 其与肿瘤的发生有密切的关系, 同p14一样, 属于INK4a/ARP位点的肿瘤抑制基因, 其翻译产物P16蛋白, 是CYC-CDK4抑制剂. P16能与CDK4亚单位结合, 而使CYC不能再与CDK4结合, 因此Rb蛋白不能被磷酸化, 阻止细胞从G1期到S期, 从而在细胞周期调节中起开关作用, 抑制细胞分裂增生, 阻止细胞进入S期而停滞于G1期. 已清楚p16基因5'端CpG岛的高甲基化与其在食管鳞状上皮细胞癌中的表达缺少有关, Wong et al[35]发现原发性胃癌中p15和p16基因的突变并不多见. mRNA转录缺陷多因DNA甲基化的紊乱所致. 他们认为DNA甲基化可能是p16基因失活的一条途径, 进而发展为胃癌. 5'端和第1外显子的异常甲基化, 使p16基因在人胃癌细胞系中不能检出, 且此转录抑制可用5-氮胞苷(一种去甲基化制剂)逆转. Shim et al[16]用MSP检测胃癌中的p16甲基化水平, 42%胃癌有高甲基化, 甲基阳性病例中(19/22)有完全的p16免疫活性丢失, 而甲基阴性病例19例只有2例. p16高甲基化同免疫活性的相关性表明, 甲基化是胃癌中p16失活的重要机制. Song et al[40]用mapping分析了9个胃癌细胞系, 发现p16表达失活伴有启动子区的高甲基化. 28例患者中的6例有p16表达缺失, 5例有启动子区的高甲基化. 这表明启动子区特殊CpG岛的从头合成甲基化与p16的转录静息有明显关系. Wong et al[35-39]从22例肝细胞肝癌(HCC)患者肿瘤组织和外周血中提取DNA, 经MSP发现73%HCC组织中p16基因甲基化, 且其中81%也在血清或血清样本中有p16基因的甲基化. 有体外研究表明, 胃癌患者因p16启动子甲基化而不表达P16蛋白的为22%, 反之, 胃炎患者该基因启动子没有甲基化现象, 而43%的胃癌和59%的癌组织附近的癌前病变组织出现p16启动子甲基化现象, 这说明该基因启动子甲基化发生在胃癌形成的早期, 而且频率较高, 可成为胃癌危险性的预测性生物标记[25,41-46].

p15为CDKIs抑制剂, 属于肿瘤抑制基因. 在胃癌中p15缺失或突变十分少见, 但由于其CpG岛甲基化而导致其mRNA转录异常, 这样就导致该基因失活, 从而成为影响胃癌形成的一种方式. Lee et al[34,35]发现6种胃癌细胞株没有表达p15 mRNA, 用去甲基化剂处理后又得到表达. Leung et al[46-48]用甲基化特异的PCR法对5种胃癌细胞株, 26例冰冻胃癌组织的p15和p16的甲基化状态进行检测发现, 4个胃癌细胞株有p15的甲基化紊乱, 3个细胞株有p16的甲基化紊乱, 26例胃癌患者有73.1%存在p15的高甲基化, 64.5%存在p16的高甲基化. 这一结果表明多肿瘤抑制基因p15和p16基因的失活与胃癌的发生有关.

1.2 p21WAF1、p27KIP1和p57KIP2基因

p21WAF1、p27KIP1和p57KIP2的基因产物分别为P21、P27和P57蛋白, 它们在结构上具有部分同源性, 几乎可与每一种CYC-CDK复合物结合而使其丧失激酶活性, 使Rb蛋白和P53蛋白不被磷酸化而抑制细胞进入S期. p21WAF1是一种多信号诱导的生长抑制因子, 对细胞内信号如p53和细胞外信号TGF-β均能作出反应. p27与G1期的细胞停顿有关, 可由TGF-β和细胞接触导致的细胞生长停滞诱导产生. 对多种人类肿瘤中p21WAF1、p27KIP1和p57KIP2进行研究发现, 仅有少量肿瘤表现出其遗传性的改变, 这表明CDKIs家族突变性的失活并不常见, 因此有人猜测启动子区的高甲基化可能是它们失活的机制. Shin et al[49]采用甲基化特异性的限制性内切酶酶解后PCR测定胃癌细胞株中p21WAF1、p57KIP2启动子区的甲基化状态发现, p21WAF1和p57KIP2在这8株胃癌细胞中都是失活的, 但这8株胃癌癌细胞却无一例外存在p21启动子的高甲基化, 而有5株细胞存在p57的甲基化, 且能被去甲基化制剂5-氮-2'脱氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine, 5-aza-dC)重新激活. Shin的结果显示, 胃癌细胞中p21基因启动子并未甲基化, 即甲基化并不是胃癌细胞中p21失活的机制. 反之, 胃癌中p57基因的失活与启动子区的甲基化有关. 同时, 他们也发现在这8株胃癌细胞中不存在p27基因的失活. Shannon et al[50]也发现结直肠癌组织细胞中p21基因的失活与甲基化无关.

1.3 APC基因

APC(adenomatous polysis coli)最初是在结肠腺瘤性息肉病中发现的. 在5q21位的APC基因为一个典型的抑癌基因, APC编码产生的蛋白质含2 843个氨基酸, 其蛋白参与修饰转录性活化和细胞周期的调节. 在人类多种肿瘤中发现其结构异常, 该基因突变后所产生的突变蛋白较野生型APC蛋白明显缩短, 突变蛋白以显性抑制方式(dominant negative manner)与野生型APC蛋白结合, 抑制后者的正常功能[51-55], 这说明APC基因可能涉及广谱人类肿瘤的发生[56,57]. 通过对胃癌APC基因的分析发现[58,59]APC基因没有发生突变, 通过MSP对胃癌标本和胃癌细胞株的分析发现: 82.5%的原发性胃癌、97.5%胃癌患者的癌旁胃黏膜和10个胃癌细胞株APC启动子1A呈高甲基化, 而启动子1B却没有发生甲基化. 由于甲基化, 在10个细胞株中, 外显子1A没有出现APC表达, 而外显子1B却出现APC表达. 说明APC启动子1A甲基化在胃癌形成的早期就出现, 是有用的生物标记.

2 与胃癌相关的癌基因甲基化

DNA甲基化是维持细胞遗传稳定性的重要因素之一, 某些癌基因的甲基化水平降低或模式改变与癌基因的激活和表达及细胞的恶变有关[60]. 目前有学者对胃癌组织中c-myc、c-Ha-ras癌基因位点的甲基化状态进行了研究.

2.1 c-myc、c-Ha-ras癌基因

c-Ha-ras癌基因参与细胞生长、分化的调控以及多种肿瘤的形成和发展. c-myc是一种高度保守的DNA结合蛋白类癌基因, 参与包括复制、生长发育、新陈代谢、细胞增殖分化和凋亡在内的多种细胞功能. 杨丽et al[61]应用限制性内切酶HapⅡ和MspⅠ结合Southern杂交方法, 对人胃癌及其癌旁组织中c-myc和c-Ha-ras基因的甲基化模式进行了检测, 结果表明与正常组织相比, 约40%-50%的胃癌组织两者甲基化水平降低. 进一步的研究显示, c-myc基因的第3外显子是基因启动与否的关键点, 许多肿瘤细胞通过此部位DNA的去甲基化使c-myc癌基因的转录发生改变. 沈兰兰et al[62]将22例进展期胃癌的癌区、癌旁和外周正常区组织的DNA, 以限制性内切酶HapⅡ/MspⅠ消化、Southern blot分析其c-myc癌基因片段的甲基化情况. 结果发现10/22的胃癌区和13/22的胃癌旁组织的c-myc癌基因呈低甲基化状态. 杨定成et al[63]研究结果表明, 胃癌组织中c-Ha-ras基因低甲基化发生频率较高(45%), 所以去甲基化是胃癌发生过程中c-Ha-ras癌基因激活的一个重要方式. 研究还发现临床Ⅱ期胃癌其c-Ha-ras基因低甲基化发生率是62.5%, 显著高于临床Ⅲ期和Ⅳ期, 提示c-Ha-ras低甲基化是胃黏膜细胞早期癌变的一个重要遗传学事件.

3 与胃癌相关的癌基因甲基化
3.1 fas

fas基因为凋亡促进基因, 它主要是通过Fas-Fas配体系统介导肿瘤细胞凋亡. 在活化T淋巴细胞膜上表达, 产生死亡信号. 在结直肠癌组织中存在fas基因的表达减少或消失. 但是Fas基因的杂合性缺失或重排却并不是引起其表达沉默的主要因素. 因此有人认为fas基因启动子的高甲基化可能是导致其不表达的一种因素. 但Butler et al[64]的实验不支持这一说法. 他们检测了46例结直肠癌的组织未发现存在fas基因启动子区的高甲基化.

3.2 bcl-2

bcl-2基因是一凋亡抑制基因. 它不同于一般意义上加速细胞增殖而致癌的癌基因, 它是通过抵抗多种形式的细胞死亡, 延长细胞寿命, 使细胞数目累积增多来促进肿瘤形成的. 而且, bcl-2还可以通过抑制c-myc和p53等基因诱导细胞的凋亡. 在结直肠癌中经常存在着bcl-2基因的表达紊乱. Babidge et al[65]研究发现, 在结直肠癌中bcl-2基因的第2号外显子的CpG位点存在着从头(De novo)甲基化, 但这个特定地点的甲基化与bcl-2 mRNA的表达并无直接关联.

3.3 survivin

关于该凋亡抑制基因, 只有卵巢癌的相关研究[66], 目前尚无消化系细胞或肿瘤细胞的研究报道.

4 DNA错配修复基因

错配修复基因(mismatch repair genes, MMR genes)是细胞内负责对碱基错配进行修复的基因, 它们的缺陷导致癌相关基因突变不能及时有效纠正, 从而肿瘤易感. 20多年前, DNA错配修复系统首先在原核生物中被发现, 随后在酵母及更高等的真核生物中亦发现相似的MMR活性. 而对人类MMR基因的研究随近几年对遗传性非多发息肉型结肠癌(HNPCC)的遗传性的研究得到了快速的发展. 自1993年由Fishel et al[67]分离克隆到第一个人类MMR基因hMSH2后, 到目前为止, 相继6种MMR基因被分离克隆并定位, 它们的基因产物及功能(表1). 而1997、1998年又发现的hMSH4、hMSH5目前只知它们和细胞有丝分裂有关, 还不能肯定它们是否具有错配修复作用, 故而未列入下表.

表1 错配修复基因的产物及其功能.
基因 (年代)定位开放阅读框架全长产物功能
HMSH2 (1993)2p162802 bp934 aa与DNA双链中的G-T、A-C错配特异结合与(CA)4及含14个碱基的IDL型错配结合
HMLH1 (1994)3p21.32268 bp756 aa形成多聚体复合物, 参与错配修复反应, 可能与细胞烷化剂耐受及细胞周期检验点有关
HPMS1 (1994)2q31-q332796 bp932 aa形成多聚体复合物, 参与错配修复反应
HPMS2 (1995)7p222586 bp862 aa与Hmlh1形成二聚体hMutL-识别新生DNA链可能与基因重组及染体联会有关
GTBP/HMSH6 (1995)2p16全长4.2 kb160 ku蛋白与hMSH2形成二聚体复合物hMutS-结合到错配区
HMSH3 (1995)5q11-13全长160 kb不明可能是一些显示微卫星序列不稳定而又无明显错配修复功能或其他知错配修复基因缺陷的肿瘤发生的相关基因

目前MMR基因的作用机制仍不很清楚, 通过对酵母和人类肿瘤细胞错配修复功能的研究, 推测可能是MMR基因编码的错配修复蛋白之间相互作用形成异二聚体, 参与细胞错配修复反应. hMSH2蛋白与其它两个MMR蛋白即hMSH6、hMSH3形成各自的异二聚体, 其复合物分别为hMutS-a和hMutS-b, 它们分别对碱基-碱基错配及插入-缺失突变进行识别, 并与错配位点结合[68]. hMLH1和hPMS2蛋白结合形成hMutL-a二聚体, 与结合到DNA链上的hMutS形成一种暂时性的复合物, 从而启动错配修复, 与有关的酶(如核酸外切酶、DNA聚合酶、复制因子等)相互配合, 切除含有错配碱基的一段DNA链, 然后重新合成一段DNA链, 以代替被切除的DNA链, 这样就修复了含错配碱基的DNA核苷酸序列, 从而有效防止DNA复制错误或微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)的产生. 通过对hMLH1基因在胃癌中的特点进行分析发现[68-72], 在胃癌中出现hMLH1蛋白表达异常, 用MSP分析发现该基因启动子高甲基化. 有MSI者由于hMLH1高甲基化而导致其不表达, 而没有MSI者因为该基因未甲基化而表达, 说明hMLH1基因启动子高甲基化可能是MSI在胃癌中频繁出现的原因. 在乳头状腺癌中, 由于hMLH1 CpG岛甲基化与基因错配修复有一定的相关性, 通过对hMLH1启动子甲基化的胃癌患者没有癌变的胃黏膜进行甲基化分析发现, 有71%也出现甲基化, 说明该基因甲基化是早期胃癌发展过程中最初的重要的特点, 可以预测乳头状腺癌MSI型的发展程度.

5 前景与展望

通过对与胃癌相关的癌基因、抑癌基因、与凋亡相关的基因和DNA错配修复基因的甲基化情况分析发现, 胃癌可出现多种基因甲基化状态改变. Lee et al[42]对54例胃腺癌患者的肿瘤组织及血浆中发生高甲基化的基因进行检测, 发现60%的胃癌细胞株和84.6%的胃癌标本出现2种或2种以上的基因甲基化, 69.2%的胃癌标本出现3种以上的基因甲基化. 多种基因甲基化是胃癌形成的重要机制. 对胃癌基因甲基化特点的分析发现, 由于启动子区甲基化改变在肿瘤初期即可发生, 揭示了肿瘤形成的可能机制, 这为胃癌的早期诊断提供了生物学标记, 也为胃癌的治疗和预后提供了新的思路. 综上, 近几年由于研究甲基化手段的进步, 使更多的胃癌相关基因的甲基化情况得以明确, 但迄今为止尚未见临床上利用上述胃癌相关基因甲基化状态的改变进行胃癌的早期诊断及干预甲基化的基因治疗来防治胃肠系肿瘤的发生. 如何充分利用上述研究成果, 尚有很多问题有待解决: (1)胃癌发生、发展的分子机制目前尚未有确切定论; (2)是否存在胃癌特异性基因发生甲基化状态改变, 国内、外未见相关文献报道; (3)究竟基因的甲基化状态改变与胃癌的发生、发展相互间关系如何, 尚有待于进一步研究; (4)目前的研究多集中在已建立的胃癌细胞系或遗传家系上, 而对散发性肿瘤的相关研究相对较少, 弄清楚散发性胃癌中基因甲基化状态的改变及其作用方式并建立相应的筛查技术, 将为胃癌的研究带来更深入的发展; (5)能否找到一些特异、灵敏、相对简单的实验方法来筛查高危人群, 实现胃癌的早期诊断, 为肿瘤学的临床应用开辟一个新的领域.

电编:张敏 审读:张海宁

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