临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-10-15; 13(19): 2339-2342
在线出版日期: 2005-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i19.2339
便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳分析
彭丽华, 杨云生, 孙刚, 王巍峰
彭丽华, 杨云生, 王巍峰, 孙 刚, 中国人民解放军总医院消化内科 北京市 100853
彭丽华, 女, 1972年生, 北京市人, 汉族, 硕士, 主治医师, 主要从事消化系疾病的临床工作和胃肠功能性及动力疾病的研究.
通讯作者: 杨云生, 100853, 北京市复兴路28号, 解放军总医院消化内科. yangys@163bj.com
电话: 010-66939747
收稿日期: 2005-08-06
修回日期: 2005-08-14
接受日期: 2005-08-25
在线出版日期: 2005-10-15

目的: 分析便秘型肠易激综合征(C-IBS)患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达的差异.

方法: 采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法, 对C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质进行分离和比较分析.

结果: 正常对照组平均胶蛋白斑点数为308, C-IBS组平均胶蛋白斑点数为238, 与正常对照组平均胶匹配点数为178, 匹配率74.79%. 有18个蛋白质点的表达量存在明显差异, 其中有3个蛋白点表达发生明显上调, 有15个蛋白点表达发生明显下调.

结论: C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达存在明显差异, 可能与C-IBS的发病机制有关.

关键词: 结肠疾病; 便秘; 蛋白质组; 双向凝胶电泳; 肠易激综合征
引文著录: 彭丽华, 杨云生, 孙刚, 王巍峰. 便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳分析. 世界华人消化杂志 2005; 13(19): 2339-2342
Proteomic analysis of colonic mucosa by two-dimensional gel electrophoresis in constipation-predominant irritable bowel syndrome
Li-Hua Peng, Yun-Sheng Yang, Gang Sun, Wei-Feng Wang
Li-Hua Peng, Yun-Sheng Yang, Gang Sun, Wei-Feng Wang, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
Correspondence to: Yun-Sheng Yang, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, 28 Fuxing Road, Beijing 100853, China. yangys@163bj.com
Received: August 6, 2005
Revised: August 14, 2005
Accepted: August 25, 2005
Published online: October 15, 2005

AIM: To analyze the differential expression of proteome in colonic mucosa between patients with constipation-predominant irritable bowel syndrome (C-IBS) and the healthy controls.

METHODS: Two dimensional polyacrylamide gel elect-rophoresis (2-DE) technique and computer-assisted image analysis were used to separate the protein spots and analyze the differential expression of proteome in the colonic mucosa of the healthy controls and patients with C-IBS.

RESULTS: A total of 308 protein spots were identified in the av-erage gel of the healthy controls, and 238 in patients with C-IBS. A total of 178 protein spots were matched, and the mean matching rate was 74.49%. There were 18 protein spots that were significantly differentially expressed. Of those 18 protein spots, the expression of 3 spots were increased markedly, while 15 were decreased significantly.

CONCLUSION: The proteomic expression in colonic mu-cosa of patients with C-IBS is significantly different from that of the healthy contr ols, which may be associated with the pathogenesis of C-IBS.

Key Words: Colonic diseases; Constipation; Proteome; Two-dimensional gel electrophoresis; Irritable bowel syndrome
0 引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是以腹痛或腹部不适伴排便异常为特征的一种功能性肠病, 便秘型IBS(constipation-predominant IBS, C-IBS)是其中的一种亚型[1-5]. 目前对IBS发病机制的研究涉及神经、免疫、内分泌等诸多方面[6-12], 但其确切的发病机制尚不清楚. 采用蛋白质组学分析可以识别及鉴定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式, 从蛋白质整体水平上探讨一些重要的生理、病理现象的本质, 揭示疾病发生、发展的规律. 我们应用双向凝胶电泳技术对C-IBS患者和正常人的结肠黏膜组织进行分析, 以期发现其蛋白质表达的差异, 为揭示IBS的发病机制提供依据.

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 结肠黏膜组织: C-IBS组4例, 诊断符合功能性胃肠疾病罗马Ⅱ诊断标准. 正常对照组取自健康学员及肠息肉内镜下切除术后复查正常者共4例, 无消化系统、神经系统症状和体征, 无近期服药史, 结肠镜检查排除肠道器质性病变者. 每例分别于回盲部、直肠、乙状结肠每部位取活检2块, 共6块, 于冰盐水(含0.1 mmol/L PMSF)中清洗干净, 滤纸吸去多余的液体, 立即置液氮中速冻保存备用, 此过程在组织离体10 min内完成.

1.1.2 试剂: 超纯尿素(urea), 硫脲(sulfocarbamide), 丙烯酰胺(acrylamide), 甲叉-双丙烯酰胺(Ｎ,Ｎ'-methylenebisacrylamide), 十二烷基磺酸钠(SDS), 过硫酸铵(APS)均购自sigma公司, 二硫苏糖醇(DTT), 甘氨酸(glycine)购自Promega公司, 四甲基乙二胺(TEMED)购自Bio-Rid公司, 碘乙酰胺(indoacetamide)购自Acros公司. 苯甲基磺酰氟(PMSF)购自北京中预卫科生物工程部, DNA酶和RNA酶购自北京华美生物工程公司. 低分子量蛋白标记, pH 3-10固相化线性18 cm干胶条(IPG strip), IPG buffer, Destreak均购自Amersham Biosciences公司. 所用溶液均用去离子水配制.

1.1.3 仪器: 低温高速离心机(Hermle, Z323K), 超声破碎机(Artek, Altrasonic 2 000), 紫外分光光度计(Unico, UV-2 000), 循环水浴箱(Julabo), IPG phor等电聚焦仪, IPG持胶槽, 灌胶模具, Ettan DALTⅡ电泳槽均为Amersham pharmacia biotech公司产品, 扫描仪(Umax, powerlook 2 100XL).

1.1.4 计算机分析软件: Amersham Biosciences公司的ImageMaster 2D version 5.0软件.

1.2 方法

1.2.1 结肠黏膜组织蛋白质的提取: 按40 mg样品加100 mL组织裂解液的比例加入裂解液(8 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 40 g/L CHAPS, 20 g/L TritonX-100, 40 mmol/L tris, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L MgCl2, 60 mmol/L DTT, 1 mmol/L PMSF 0.1 g/L DNA酶, 0.025 g/L RNA酶), 置冰浴上予匀浆器手工匀浆. 匀浆液予超声破碎仪破碎, 每次10 s, 共6次. 以14 000 g置于4 ℃离心30 min. 取上清, 分装, 贮存于-70 ℃冰箱, 同时用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质浓度.

1.2.2 第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦: 主要按Gorg et al[13]方法略有改动. 取上述蛋白质样品, 按1 mg的上样量计算出蛋白质上样体积, 依该体积加入蛋白质样品, 加入重泡胀液(8 mol/L尿素, 20 g/L CHAPS, 痕量溴酚蓝), 1.75 mL IPG Buffer, 4 mL Destreak至终体积350 mL, 在液体快速混合器及手掌型离心机上分别混匀. 将样本均匀加入持胶槽中, 胶面向下放入18 cm IPG干胶条, 避免气泡产生, 然后滴加覆盖油800 mL, 置于IPG phor等电聚焦仪上. 重泡胀和等电聚焦在20 ℃下自动进行, 自动程序电泳参数设置如下: 重水化0 V 14 h→200 V 1 h→500 V 1 h→1 000 V 1 h→3 000 V 1 h→4 000 V 1 h→8 000 V 4 h, 至30 000 V h. 等电聚焦后, IPG胶条分别在平衡液A(50 mmol/L tris-HCl pH 8.8, 6 mol/L尿素, 300 mL/L甘油, 20 g/L SDS, 痕量溴酚蓝, 10 g/L DTT)和平衡液B(50 mmol/L tris-HCl pH 8.8, 6 mol/L尿素, 300 mL/L甘油, 20 g/L SDS, 痕量溴酚蓝, 25 g/L碘乙酰胺)中各平衡15 min后用去离子水润洗胶条1 s, 并用滤纸吸去多余的液体.

1.2.3 第二向垂直平板SDS: PAGE配制125 g/L的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶. 将平衡后的IPG胶条胶面向上移至凝胶的上方, 胶条一端放上低分子量蛋白标记10 mL, 5 g/L的琼脂糖封闭. 电泳参数: 初始功率为5 w, 45 min, 待溴酚蓝前沿移入SDS胶时, 以恒功率30 w, 直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止, 约3.5 h.

1.2.4 考马斯亮蓝染色: 将凝胶在固定液(甲醇400 mL/L, 冰乙酸100 mL/L, 去离子水500 mL/L)中固定40 min, 脱色液(乙醇250 mL/L, 冰乙酸80 mL/L, 去离子水670 mL/L)中脱色2 min, 0.2 g/L考马斯亮蓝染色液中染色60 min, 然后在脱色液中脱色10 min、20 min, 更换脱色液过夜.

1.2.5 凝胶图象采集与分析: 应用Umax powerlook 2100XL扫描仪采集凝胶图象, 应用Amersham Biosciences公司的ImageMaster 2D version 5.0软件进行图象分析.

2 结果
2.1 C-IBS组和正常对照组结肠黏膜蛋白质组双向凝胶电泳图谱

经图象分析显示在相同设定值条件下获取的蛋白斑点, 以其中一块胶为参考胶进行4块胶间的斑点匹配. 图1A所示为正常对照组结肠黏膜组织双向凝胶电泳平均胶图谱. 图1B所示为C-IBS组结肠黏膜组织双向凝胶电泳平均胶图谱. 两个样品以pI = 4.5-10和分子质量13-90 ku范围的蛋白斑点分布最多. 正常对照组平均胶蛋白斑点数为308, C-IBS组平均胶蛋白斑点数为238, 与正常对照组平均胶匹配点数为178, 匹配率74.79%.

图1
图1 结肠黏膜组织双向凝胶电泳平均胶图谱. A: 正常对照组; B: C-IBS组.
2.2 C-IBS蛋白质组的表达变化

比较两组平均胶, 发现有18个蛋白质点的表达存在明显差异. 其中有3个蛋白点表达发生明显上调(表1, 序号同图1B标注的蛋白点序号), 有15个蛋白点表达发生明显下调(表2, 序号同图1B标注的蛋白点序号).

表1 C-IBS组发生明显上调的蛋白点信息.
NoSpotMatch NoVolumn(CV)
pIMr/ku
C-IBSControl
1692411 709.0005 487.5007.19569.369
21085145 708.66723 813.0005.82360.214
31155825 387.6678 235.5005.76958.234
表2 C-IBS组发生明显下调的蛋白点信息.
NoSpotMatch NoVolumn(CV)
pIMr/ku
C-IBSControl
4601917 915.66734 306.5005.23870.907
5642044 161.33367 592.5005.36370.568
6742815 988.00029 635.0005.72568.129
7752730 366.33353 379.5005.82667.870
820614524 863.00037 939.5005.62732.208
922817624 863.00011 593.0005.34128.444
102411876 030.0009 242.5007.10326.433
112652175 574.00019 161.0005.11419.974
1226622010 164.66769 590.5005.80119.879
132792389 521.00015 876.5007.59517.988
1428224324 688.66749 402.0005.60617.523
152912538 079.33313 286.0006.88116.493
163032709 117.00016 816.0005.26715.618
1730827997 098.667197 559.0007.19215.250
1831228077 492.333157 468.0006.33615.123
3 讨论

IBS是一种常见的消化系疾病, 但其发病机制尚不清楚, 一般认为是一种功能性肠病, 发病机制有肠道运动异常机制、内脏高敏感性机制[14,15]、脑肠相互作用机制[16]、5-羟色胺作用机制[17,18], 以及近年来提出的神经免疫内分泌网络调控机制[19]等. 近年来对于IBS发病机制的研究取得了长足的进步, 已发现IBS患者可能存在肠道肥大细胞(mast cell, MC)数目及活性的改变[20-22], 血中或结肠黏膜5-羟色胺(5-hydroxymetryptamine, 5-HT)[23,24]、胃动素、血管活性肠肽等胃肠激素[25-27]的异常, 白三烯B4、组胺等血清生物活性物质的改变[28], 外周血淋巴细胞CD4/CD8比值的变化[29], 提示IBS肠道功能异常与肠黏膜一些细胞及分子的变化具有关系; 近来也有研究发现IBS肠道平滑肌间有淋巴细胞浸润、间质细胞数目改变、神经元变性[30], 脑、脊髓、肠道神经递质改变等[31,32], 这些研究都为IBS的病理机制提供了细胞分子生物学的基础. 运用双向凝胶电泳的研究方法, 可以识别结肠黏膜组织表达的蛋白质谱, 从整体上把握蛋白质表达的差异, 为IBS发病机制的研究提供线索.

我们通过改进蛋白质提取过程和优化双向凝胶电泳参数, 得到了分辨率和重复性良好的双向凝胶电泳图谱, 匹配率74.79%, 完全能够满足进行蛋白质组研究所需的要求. 其中关键的步骤是裂解液的组成成分, 蛋白质提取时裂解液与组织的配比, 上样量的选择, 一向IPG胶条的选择, 二向SDS凝胶浓度的选择以及双向电泳参数的设置等. 通过比较C-IBS患者和正常人结肠黏膜组织蛋白质组电泳图谱得到蛋白质在表达数量和强度上的差异, 对这两种蛋白质组表达差异的分析结果显示, 细胞内多种蛋白成分在疾病发生发展过程中出现了变化, 有3个蛋白点表达发生明显上调, 有15个蛋白点表达发生明显下调. 这些蛋白质成分可能参与了IBS生物学特征改变的调节与控制. 我们已获得了这些蛋白质的分子量和等电点, 在筛选出这些差异表达蛋白质的基础上, 进一步的质谱分析可以鉴定这些蛋白质的种类, 明确其功能, 为认识疾病发病机制提供线索. 对IBS患者的蛋白质组学研究不仅能为揭示IBS的发病机制提供新的研究方向, 其发现的差异表达蛋白质也可能成为疾病诊断的分子标记, 进而还可能成为治疗和药物开发的靶点, 因而具有重要的理论和实践意义.

电编:张敏 编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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