谷氨酰胺对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时肝组织谷胱甘肽含量和细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

摘要

目的: 探讨谷氨酰(glutamine, Gln)对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)时肝组织谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.

方法: 用健康♂Wistar大鼠随机分为谷氨酰胺组(G组)和对照组(C组). 预置中心静脉导管后经此输液通道分别注入谷氨酰胺溶液和生理盐水行预处理(3 d). 采用Pringle法夹闭肝十二指肠韧带致肝脏缺血30 min后, 去夹恢复血流为再灌注. 分别于再灌注后1、24 h抽血检测ALT的水平, 然后快速切取肝组织检测其还原型GSH的含量, 切取部分肝组织用于组织病理学检查, 并采用S-P免疫组织化学染色方法检测肝组织细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的蛋白表达情况.

结果: 再灌注后1、24 h, G组血清ALT水平皆显著低于C组(8.3±2.0 mkat/L vs 13.7±5.5 mkat/L, P<0.05; 2.9±2.5mkat/L vs 9.1±4.3 mkat/L, P<0.01). 肝脏组织GSH的水平: 再灌注后1、24 h, G组肝组织GSH水平皆明显高于C组(1216.09±152.78 mg/g vs 856.68±117.64 mg/g, P<0.01; 899.73±57.75 mg/g vs 800.50±94.79 mg/g, P<0.05). 肝组织损害的病理学改变G组明显轻于C组. 再灌注后1、24 h, G组肝组织Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于C组(100.0% vs37.5%, P<0.05; 87.5% vs 25.0%, P<0.05); 再灌注后1、24 h, G组肝组织Bax蛋白阳性表达率明显低于C组(25.0% vs87.5%, P<0.05; 25.0% vs 87.5%, P<0.05)

结论: Gln对大鼠HIRI具有保护作用, 其作用机制可能与维持体内GSH含量和影响肝组织细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白的表达有关.

关键词: 谷氨酰胺; 肝脏缺血再灌注损伤; 谷胱甘肽; Bcl-2; Bax

Effects of glutamine on glutathione content and expression of Bcl-2 and Bax protein during hepatic ischemia and reperfusion injury in rats

Chang-Jun Jia, Chao-Liu Dai, Xu Zhang, Feng Xu, Kai Cui, Yong-Qing Xu

Chang-Jun Jia, Chao-Liu Dai, Xu Zhang, Feng Xu, Yong-Qing Xu, Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital (Shengjing Hospital) of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Kai Cui, Department of General Surgery, the Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China

Supported by: the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20022063.

Correspondence to: Professor Chao-Liu Dai, Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital (Shengjing Hospital) of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. daicl-sy@tom.com

Received: September 21, 2005
Revised: September 25, 2005
Accepted: September 30, 2005
Published online: October 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the effect of alanyl-glutamine dipeptiven (Ala-Gln) on the content of glutathione (GSH) and the expression of Bcl-2 and Bax protein during hepatic ischemia and reperfusion injury (HIRI) in rats.

METHODS: A total of 48 Wistar rats were randomly divided into glutamine group (group G) and control group (group C), which were pretreated with Gln and normal saline, respectively. The liver was subjected to warm ischemia by Pringle method for 30 min, and then reperfused. The serum samples were colleted 1 and 24 h after the reperfusion, and the level of serum ALT was measured. The GSH content and histopathological changes were detected in the liver tissues. The expression of Bcl-2 and Bax protein in the liver tissues were detected by immunohistochemistry.

RESULTS: The level of serum ALT was significantly lower in group G than that in group C 1 and 24 h after the reperfusion (8.3 ± 2.0 mkat/L vs 13.7± 5.5 mkat/L, P < 0.05; 2.9 ± 2.5 mkat/L vs 9.1 ± 4.3 mkat/L, P < 0.01), but the GSH content was significantly higher in group G than that in group C (1216.09 ± 152.78 mg/g vs 856.68 ± 117.64 mg/g, P < 0.01; 899.73 ± 57.75 mg/g vs 800.50 ± 94.79 mg/g, P < 0.05). The histopathological changes were significantly slighter in group G than those in group C. One and twenty-four hours after the reperfusion, the positive rate of Bcl-2 protein expression was significantly higher in group G than that in group C (100.0% vs 37.5%, P < 0.05; 87.5% vs 25.0%, P < 0.05), while the positive rate of Bax protein expression was significantly lower in group G than that in group C (25.0% vs 87.5%, P < 0.05; 25.0% vs 87.5%, P < 0.05).

CONCLUSION: Ala-Gln (Gln) can protect rats against HIRI, and the mechanism may relate to the enhancement of GSH content and the regulation of Bcl-2, Bax protein expression.

Key Words: Glutamine; Hepatic ischemia and reperfusion injury; Glutathione; Bcl-2; Bax

0 引言

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury, HIRI)始终是肝脏外科发展中的一个难题, 其具体发生机制尚未完全明确, 多数学者认为与氧自由基和钙离子超载等多种因素有关[1].

目前研究表明, 谷氨酰胺(Gln)在肠道、心肌和骨骼肌等组织的缺血再灌注损伤过程中具有保护作用[2-4], 而这种保护作用部分是与其维持组织中谷胱甘肽(GSH)含量的相对高水平有关.

细胞凋亡是受基因调控的一种细胞主动死亡形式, 其过程受凋亡抑制基因bcl-2和凋亡刺激基因bax等众多细胞凋亡相关基因的影响[5]. 已有研究证实, 体内GSH的缺乏可导致bcl-2基因表达减少, 加重组织细胞的凋亡程度[6], 而肝细胞中bcl-2基因表达的增强则对大鼠HIRI具有保护作用[7].

目前对于Gln在HIRI中的保护作用以及Gln对肝组织GSH含量和细胞凋亡相关基因Bcl-2、bax蛋白表达的影响等方面的研究报道尚不多见. 因为Gln的溶解度低及性质的不稳定, 目前在临床中, 多采用丙氨酰-谷氨酰胺(Alanyl-Glutamine, Ala-Gln)双肽代替Gln[8]. 我们通过建立大鼠静脉营养输液模型和HIRI模型, 观察术前给予Gln对大鼠肝脏的保护作用以及对肝组织GSH的含量和细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

健康♂Wistar大鼠, 体质量200-300 g, 由中国医科大学盛京医院动物实验中心提供. 大鼠分单笼喂养1 wk, 期间随意进食(普通混合饲料, 不含Gln), 自由饮水, 12 h照明, 以充分适应环境. 丙氨酰-谷氨酰胺二肽(力太), 购自德国费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)华瑞制药有限公司(SINO-SWED PHARMA-CEUTICAL CORP.LTD.). GSH试剂盒购自南京建成生物工程研究所. Bcl-2兔抗鼠单克隆抗体和Bax兔抗鼠单克隆抗体均购自北京中山生物技术有限公司, 为美国SANTA CRUZ公司产品.

1.2 方法

(1)大鼠静脉输液模型的建立: 参照第三军医大学静脉营养模型[9], 并稍加改动. 大鼠术前禁食12 h, 100 g/L乌拉坦按0.1 mL/kg ip麻醉. 经右侧颈外静脉置入中心静脉插管. 术后将大鼠置于代谢笼中, 允许自由活动, 期间随意食水. 插管后2 h始用微量泵持续输注生理盐水(速率为2 mL/h), 观察3 d. (2)实验分组: 48只大鼠随机分为Gln组(G组, n = 24), 对照组(C组, n = 24). G组给予含Gln溶液(Ala-Gln+生理盐水配制成质量比为30 g/L的溶液, 相当于20 g/L Gln溶液, 输液速率为2 mL/h), C组给予同等量的生理盐水(输液速率为2 mL/h), 共3 d, 期间仍随意食水. (4)大鼠HIRI模型的建立: 第7 d再次相同方法麻醉成功后, 将大鼠置于电热毯上以保持体温在36.5±0.5 ℃. 取正中切口入腹, 离断肝周韧带, 用无创伤微血管夹完全阻断入肝血流(Pringle法), 30 min后松开血管夹, 松动肝门恢复肝血供, 关腹. (4)取材: 再灌注后1和24 h, 分别抽3 mL腹主动脉血, 然后用镊子快速夹取肝组织, 用锡箔纸包裹置于液氮中保存, 再转至-80 ℃冰箱中保存, 待测GSH含量. 再分别取1 cm×1 cm×0.5 cm大小肝组织, 置于40 g/L甲醛溶液中固定, 备作组织病理学和细胞凋亡的免疫组化检查. 血液静置20 min后, 离心10 min(2 500 r/min), 用微量移液器将上清液移至预冷弹头中, 置于-30 ℃冰箱中冷冻保存, 待测生化指标. 最后处死大鼠.

1.2.1 血清ALT水平的测定: 用全自动生化分析仪测定血清ALT水平.

1.2.2 肝组织GSH含量的测定: 按GSH试剂盒的说明书进行操作, 计算出肝组织匀浆中GSH含量.

1.2.3 肝组织病理学改变: 肝组织块切片后常规HE染色并行光镜观察.

1.2.4 肝组织细胞凋亡相关基因蛋白表达的测定: 采用S-P免疫组织化学方法检测肝组织Bcl-2和Bax蛋白的表达. 结果判断标准参照王剑明 et al报道[10]: 胞质出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞, 切片内无阳性细胞为阴性表达(-), 阳性细胞率小于1/3为弱阳性表达(+), 1/3-2/3为中等阳性表达(+ +), 大于2/3为强阳性表达(+ + +).

统计学处理 计量资料用统计软件SPSS 11.0进行t检验, 结果用mean±SD表示, P<0.05为差别有显著性.

2 结果

2.1 血清ALT水平

再灌注后1 h, G组血清ALT水平显著低于C组(P<0.05). 再灌注后24 h, 两组血清ALT水平均较前显著下降, 而G组仍显著低于C组(P<0.01)(表1).

表1 大鼠血清ALT的水平 (μkat/L) 和肝组织还原型GSH的含量 (μg/g-1, prot) (n = 8).

组别	ALT		GSH
	再灌注1 h	再灌注24 h	再灌注1 h	再灌注24 h
G组	8.3 ± 2.0a	2.9 ± 2.5b	1216.09 ± 152.78c	899.73 ± 57.75d
C组	13.7 ± 5.5	9.1 ± 4.3	856.68 ± 117.64	800.50 ± 94.79

^aP<0.05,

^bP<0.01,

^cP<0.01,

^dP<0.05 vs C组.

2.2 肝组织GSH含量

再灌注后1、24 h, G组肝组织还孕虶SH的含量均明显高于C组(P<0.01, P<0.05)(表1).

2.3 肝组织病理学改变

再灌注后1 h, G组肝细胞仅有轻度肿胀, 少量脂肪变性, 组织结构尚清晰, 无明显炎性细胞浸润; 而C组肝细胞则明显肿胀, 胞质内脂肪及空泡样变性较重, 肝窦腔隙变窄或消失, 窦内可见大量红细胞, 局部有炎症细胞浸润, 肝包膜下可见出血. 再灌注后24 h, G组肝细胞肿胀变性略有加重, 但肝脏结构尚规整, 局部有点状坏死, 可见核分裂相; 而C组肝脏结构紊乱, 可见片状肝细胞坏死, 窦内充满红细胞, 肝窦腔隙消失, 局部炎症细胞浸润明显, 肝包膜下可见出血.

2.4 肝组织免疫组织化学染色

再灌注后1和24 h, Bcl-2蛋白阳性表达率在G组明显, C组不明显, 差别有显著性(P<0.05, P<0.05). 再灌注后1和24 h, Bax蛋白阳性表达在C组明显, G组不明显, 差别有显著性(P<0.05, P<0.05)(表2, 图1A-D).

图1 再灌注后24 h肝组织细胞凋亡相关基因的蛋白表达(S-P免疫组织化学染色×400). A: G组Bcl-2; B: C组Bcl-2; C: G组Bax; D: C组Bax.

表2 大鼠肝组织Bcl-2和Bax蛋白阳性表达情况.

组别	Bcl-2蛋白						Bax蛋白
	阳性表达程度				总表达情况		阳性表达程度				总表达情况
	-	+	++	+++	n	百分数(%)	-	+	++	+++	n	百分数(%)
G组(1 h)	0	0	0	8	8	100.0a	4	2	1	1	2	25.0c
C组(1 h)	5	0	0	3	3	37.5	0	1	3	4	7	87.5
G组(24 h)	1	0	0	7	7	87.5e	5	1	1	1	2	25.0f
C组(24 h)	5	1	1	1	2	25.0	0	1	4	3	7	87.5

^aP<0.05,

^cP<0.05,

^eP<0.05,

^fP<0.05 vs C组.

3 讨论

在健康人体中, Gln是血浆中最为丰富的游离氨基酸之一, 是一种条件必需氨基酸, 应激后其循环和组织中的浓度显著下降. 当体内Gln储备减少时可以导致严重的并发症, 如感染、伤口愈合不良、免疫功能下降、肠黏膜通透性增加和最后可能发生的多器官功能衰竭[11,12]. 已有研究证实Gln在肠道、心肌及骨骼肌的缺血再灌注损伤过程中具有保护作用[2-4]. 本实验中, 在肝脏缺血再灌注后不同时点G组血清ALT水平均显著低于C组, 且G组肝组织的病理学损害程度亦显著低于C组, 说明术前给予Gln对HIRI过程同样具有保护作用.

Gln是肠道细胞的主要代谢燃料, 术前给予可维持入肝血流完全阻断所致门静脉系统淤血时小肠黏膜细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的代谢和功能, 促进肠黏膜细胞分裂增殖, 加快上皮增生与修复, 保护肠黏膜屏障, 减轻肠道细菌及内毒素易位, 进而抑制了淤滞的门静脉血再灌注对肝脏枯否氏细胞的激活, 抑制了TNF-α、IL-1等细胞因子的释放和氧自由基的产生, 从而减轻了对肝脏的损伤[13,14].

Gln是合成GSH的重要前体物质, 而GSH是机体保护酶和其他蛋白质巯基、对抗氧自由基损害的一种重要的抗氧化剂. 研究表明Gln对肠道、心肌及骨骼肌等器官缺血再灌注损伤过程中的保护作用与其提高机体内GSH的含量密切相关, 而提高体内GSH的含量对HIRI具有保护作用[2-4,15]. 本实验中再灌注后1和24 h, G组肝组织中GSH的含量均显著高于C组(P<0.01, P<0.05). 这提示Gln对HIRI的保护作用和肠道等器官一样, 与提高体内GSH含量, 加强对抗缺血再灌注过程中氧自由基的损害作用等有关.

近年来实验表明, 细胞凋亡在HIRI过程中起着重要作用, 其发生与氧自由基、细胞因子、能量代谢等有密切关系[16]. bcl-2基因是最重要的抗凋亡基因之一, 其蛋白位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上, 能防止多种原因引起的细胞凋亡, 而bax基因是近年来新发现的一种促凋亡基因, 其与bcl2基因的氨基酸编码有21%的同源性. bcl-2和bax是一对正负调节基因, 当bax同源二聚体形成时, 可诱导细胞凋亡; 随着Bcl-2蛋白表达量上升, 越来越多的bax二聚体分开, 与bcl-2形成比bax-bax同源二聚体更稳定的bax-bcl-2异源二聚体, "中和"了bax-bax同源二聚体诱导细胞凋亡的作用[5]. 通过腺病毒介导基因转染的方式增强肝组织细胞中bcl-2基因的表达对大鼠热缺血再灌注损伤具有保护作用[7]. 我们发现, 再灌注后1和24 h, G组肝组织Bcl-2蛋白阳性表达明显高于C组(P<0.05, P<0.05), 而Bax蛋白阳性表达则明显低于C组(P<0.05, P<0.05). 这说明Gln对HIRI的保护作用可能与其影响细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白的表达有关. 其原因可能为Gln的抗氧化作用中和了缺血再灌注损伤时产生的活性氧, 减少其对肝细胞和内皮细胞等的效应细胞的过氧化损伤, 相对稳定了细胞膜及核膜结构基础, 从而加强了对肝细胞膜的屏障保护作用, 抵御bax跨膜结构, 有利于相对稳定膜上bcl-2编码的Bcl-2蛋白的结构基础, 增强了Bcl-2蛋白的表达, 协同发挥抑制凋亡信号传导、抗细胞凋亡的作用. 体外研究表明, Gln可在氧化应激过程中保护a-酮戊二酸脱氢酶, 使其活性不被抑制, 维持正常的三羧酸循环; Gln是合成ATP的前体, 从理论上讲, 可增加ATP含量; Gln能刺激糖原合成, 提高肝细胞糖原储备, 这些皆使得在HIRI期间可产生较多的ATP, 这对保持Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶生物活性, 稳定细胞膜, 减轻钙离子超载程度, 维持细胞内外环境稳定起决定性作用[17,18]. 另有实验表明体内GSH的缺乏可导致bcl-2基因表达减少, 加重组织细胞的凋亡程度[6], 所以Gln对Bcl-2等基因蛋白表达的影响, 可能与其维持肝组织中GSH含量的相对高水平有关.

总之, 术前给予Gln对大鼠HIRI具有保护作用, 这种作用可能与维持肝组织中GSH的含量和影响肝组织细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白的表达有关.

备注

电编:张敏 编辑:张海宁

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