乳酸杆菌作为一种新型活疫苗抗原递送载体

摘要

乳酸杆菌不仅有多种生理功能, 如控制肠内感染、抗肿瘤活性等, 还能促进小肠局部细胞免疫和体液免疫. 乳酸杆菌又是人和动物胃肠中正常存在的菌群, 作为活疫苗抗原递送载体具有很好的安全性. 因此, 乳酸杆菌是一种理想的口服基因工程苗的表达载体. 近年来, 国外一些学者已经构建了表达不同抗原的乳酸杆菌, 如炭疽杆菌保护性抗原、破伤风毒素C、霍乱毒素B亚单位、细菌素sakacin A和sakacin P等, 口服这些乳酸杆菌后动物体内均能产生特异性黏膜免疫应答反应. 本文对近几年来乳酸杆菌作为抗原递送载体的研究进展进行了总结, 并对乳酸杆菌表达抗原时存在的问题进行了讨论.

关键词: 乳酸杆菌

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 19, 2005
Revised: July 20, 2005
Accepted: July 23, 2005
Published online: September 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

几个世纪以来, 乳酸杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业, 以乳酸杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20%. 数千年, 乳酸杆菌被人类大量食用, 没有引起任何已知的健康问题, 从而使其成为安全(口服)疫苗开发的具有吸引力的候选物. 一系列复制子构建的具广泛宿主范围的质粒载体系统已成功地转化乳酸杆菌并表达内源及外源基因. 但是与医药微生物基因工程研究相比, 乳酸杆菌基因工程进展较慢, 为有利于该项基因工程的发展和产业化作综述如下.

1 口服黏膜免疫研究进展

口服黏膜免疫方法简便、安全, 不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答, 还可引起全身性体液免疫应答, 多年来受到国内外免疫学家的密切关注. 目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子. 脊髓灰质炎口服疫苗的应用, 使全球小儿麻痹发病得到有效控制, 为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用. 但是在实践中, 口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解, 疫苗很容易被破坏, 影响免疫力的效果, 使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制. 近年来疫苗投递系统成为研究传染病防御领域新技术的热点之一. 尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便, 外源基因容量大, 刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力. 细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向, 所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中, 提呈表达所编码的抗原, 以期达到预防一种或多种疾病的目的. 通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答, 又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答, 使机体可以获得全面的保护力.

以前的研究[1-4]表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体, 如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等. 国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等. 但沙门氏菌为载体传递DNA疫苗也存在潜在危险性. 首先, 减毒细菌可能存在毒力返强的危险; 其次, 质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组, 从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题[5]. 此外, 减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病性. 因此, 选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键. 理想的输送抗原的载体应该是能够在体内较长时间存在, 本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物.

2 乳酸杆菌对黏膜免疫的影响

乳酸杆菌是人体和动物肠道中一种正常的益生菌, 具有多种生理功能, 如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能, 在科学界越来越显示出强大的生命力. 作为一种重要的益生菌, 多年来乳酸杆菌被大量用于食品的制造中, 如干酪、酸乳酪和干腊肠. 数千年来人们大量的消费这些食品, 从未引起任何的健康问题. 作为口服疫苗, 乳酸杆菌还具有很好的安全性. 因此, 乳酸杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原载体.

进入胃肠道中的乳酸杆菌具备抗胆汁酸和在胃肠道中持续存在的能力. 与一般微生物抗原一样, 乳酸杆菌在诱导黏膜免疫应答时或是经过小肠上皮之间的微皱褶细胞(microfold cell, M细胞), 或者通过上皮下的树突状细胞(dendritic cell, DC)进入固有层, 激活Th2淋巴细胞, 产生大量的白介素(IL)-5, 后者是有效的IgA刺激因子, 可激活B细胞, 分泌IgA, IgA与肠黏膜上皮产生的分泌片段结合, 形成黏膜表面抗体sIgA(分泌型IgA), 阻止致病菌的吸附和入侵[6]. 许多乳酸杆菌由于抗酸、抗胆汁盐, 能够顺利通过胃和回肠, 大量存在于小肠和大肠的上游处[7]. 乳酸杆菌进入胃肠道后可持续诱导局部细胞免疫和体液免疫, 并具有减少变态反应、增强肠道屏障功能和治疗自身免疫病等功能.

乳酸杆菌能显著增加肠道中非特异性和特异性抗体水平. 对0-6个月健康新生儿的研究发现, 肠道内的乳酸杆菌和双歧杆菌定植的时间越早, 外周血中IgA定向细胞出现得就越早; 随着肠内乳酸杆菌和双歧杆菌数目的增加, 外周血中的IgA定向细胞的数量也增加; 在轮状病毒导致的腹泻婴儿中, 喂食乳酸杆菌株后可使病程减短, 病情减轻[8]; 减毒的Salmonella typhi感染小鼠后, 如果口服含有L.acidophilus La1发酵乳, 小鼠体内针对S.typhi的血清总IgA水平均升高[9]. 乳酸杆菌还可明显促进小肠中细胞免疫反应, 如乳酸杆菌能增强肠上皮淋巴细胞细胞毒活性, 诱导产生多种淋巴因子; 激发固有层CD4⁺细胞产生干扰素; 增强单核－吞噬细胞的吞噬作用, 从而杀灭肠道病毒和肠道内的其他细菌, 小鼠口服含有大量乳酸杆菌的Kefir奶可以协助特异性抗原提高小肠特异性黏膜免疫反应[10]. 乳酸杆菌中含有大量未甲基化的CpG DNA, 脂磷壁酸(lipoteichoic acids, LTA)和肽聚糖, 通常这些物质可与Toll样受体(toll like receptors, TLRs)结合, 刺激先天免疫系统产生应激反应. 所以口服乳酸杆菌对增强小肠特异和非特异性免疫应答均具有重要作用.

3 乳酸杆菌作为活疫苗抗原递送载体

乳酸杆菌是安全的益生菌, 利用一些乳酸杆菌在胃肠道、泌尿、生殖系统中或黏膜部位黏附存活且无病原性等特点, 开展活菌口服疫苗和黏膜疫苗载体的研究, 日益受到了广泛的重视. 理想的疫苗载体系统能够把表达的外源性蛋白抗原分泌到细胞外. 外源蛋白在细菌中的表达在生物技术上一直是一个挑战. 乳酸杆菌的一些菌株具有S层(S-layer), 由单一的蛋白亚单位组成规则排列的类晶格结构. 与大肠杆菌相比, 乳酸杆菌仅有一层细胞膜, 目的蛋白可在S层蛋白信号肽的引导下直接分泌到细胞外, 从而容易获得目的蛋白. 将目的抗原与乳酸杆菌S层蛋白信号肽序列融合, 将其克隆于乳酸杆菌表达质粒启动子下游, 通过电转化可以获得稳定表达抗原的乳酸杆菌. 虽然一些革兰氏阴性菌也具有S层, 但革兰氏阴性菌存在一定缺点, 如在大肠杆菌中, 重组蛋白易被内毒素污染并易以不溶的包涵体形式在细胞质中堆积; 而乳酸杆菌则能稳定的将异源性重组蛋白表达于细胞外[11]. 但是前几年乳酸杆菌的遗传和分子生物学研究进展较为缓慢, 主要是由于乳酸杆菌的转化系统研究的不够深入. 最近乳酸杆菌作为递呈保护性抗原的有效活载体有了突破性进展. 法国学者Grangette et al[^12]首先用乳酸杆菌作为破伤风毒素黏膜疫苗的抗原递送系统, 通过鼻腔免疫, 成功诱导了IgA抗体和IgG抗体的特异性体液免疫反应以及细胞免疫反应; Sorvig et al[13]应用乳酸杆菌成功构建了可表达细菌素sakacin A和sakacin P的载体; Scheppler et al[14]将编码德氏乳酸杆菌prtB蛋白酶(与破伤风毒素A的模拟表位相连)的溶血乳酸杆菌口服接种动物, 可同时产生特异性IgG应答和黏膜IgA免疫应答. 目前, 已成功构建了许多可表达不同抗原的乳酸杆菌, 如炭疽杆菌保护性抗原, 破伤风毒素片段C(tetanus toxin fragment C, TTFC)和霍乱毒素B亚单位等[15]. 乳酸杆菌有50多种, 生化特性、生态、分子构成和免疫特性均不同, 种间转录和翻译的差异也很大. 不同菌株对同一抗原的表达水平和表达产物不同, 对动物产生的抗体水平也有差别. 一种抗原在一种乳酸杆菌上的表达水平很高, 但在其他菌株表达水平并不一定高. 不同菌株可刺激淋巴细胞表达不同细胞因子, 可能与不同的基因表达有关[16]. 此外, 不同乳酸杆菌引起的免疫应答水平有所差异, 如植物乳酸杆菌作为抗原载体时的免疫应答水平比干酪乳酸杆菌要高; 不同的乳酸杆菌菌株诱导细胞因子产生的种类也不同. 因此如果诱导特定细胞因子的产生和免疫应答, 应该筛选不同的乳酸杆菌[17].

乳酸杆菌进入机体的免疫途径不同, 对动物产生的免疫反应也不同. 表达TTFC的植物乳酸杆菌经鼻腔免疫和口服免疫均可诱导特异性TTFC免疫应答. 但鼻腔免疫产生的抗体效价比口服免疫的高[18-19]. Shaw et al[18]通过口服免疫表达TTFC的植物乳酸杆菌后却检测不到特异性TTFC抗体, 可能与TTFC的表达水平太低有关. Grangette et al[12]还对乳酸杆菌死菌和活菌的效果进行了比较, 发现应用乳酸杆菌活菌接种小鼠产生的保护力水平比细菌经过丝裂霉素C处理后产生的保护力要高的多, 表明乳酸杆菌活菌诱导动物免疫反应的能力比死菌效果更好. 为了进一步提高乳酸杆菌对免疫反应的影响, 一些学者试图通过在重组的乳酸杆菌疫苗中联合表达一些细胞因子, 如在乳酸乳球菌中表达TTFC时再联合表达IL-2或IL-6. 给小鼠口服这些菌株后, 这两种细胞因子的表达可使小鼠对TTFC产生的免疫应答过程更快, 产生的特异性TTFC抗体滴度更高[20].

乳酸杆菌的基因转化需要一些合适的克隆体系. Nisin诱导型表达非常适用于乳酸杆菌的转化, 其是由NisR和NisK组成的双组分调节基因, 分别编码组氨酸激酶和应答调节物, 构成乳链菌肽生物合成的双组分调节系统[13]. 该调节系统, 在NisA和NisF启动子的控制下诱导基因的转录. 此外, 相同表达系统应用于不同乳酸杆菌菌株时, 启动子的活性、复制效率和质粒的拷贝数也会不同[21]. 在研究乳酸杆菌启动小肠免疫应答的机制时, 需要对乳酸杆菌进行标记以便于观察. GFP是一种完美的荧光标记分子, 与其他生物发光或荧光指示分子不同, 该蛋白能够自身催化形成发光结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光[22]. 作为荧光标记分子, GFP具有很多优点, 如检测方便, 荧光稳定, 易于构建载体且对活细胞无毒害, 对目的基因的功能没有影响, 转化后细胞可以继续传代. 因此, GFP是稳定的非种属限制的标记分子, 能够检测活体细胞的运动. 在食品科学界, Gory et al[23]和Arellano et al[22]先后在食品中的乳酸杆菌成功构建了表达GFP的载体. Gory将GFP基因插入L.sakei组成型启动子的下游, 可在干腊肠中直接观察到GFP阳性的L.sakei. Geoffroy et al[24]报道, 给小鼠口服GFP标记的植物乳酸杆菌, 结果发现荧光蛋白标记的乳酸杆菌大部分都存在于肠黏液中或游离于肠腔中. 鼻腔接种GFP标记的植物乳酸杆菌, 发现乳酸杆菌被支气管肺泡冲洗液中的巨噬细胞吞噬, 但标记的乳酸杆菌如何进入小肠上皮诱导局部免疫反应尚未见有报道.

总之, 乳酸杆菌最令人感兴趣的新领域之一是利用乳酸杆菌作为口服疫苗的载体. TTFC在乳酸杆菌中的成功表达证明将乳酸杆菌应用于黏膜免疫是完全可行的. 在许多动物模型中进行的黏膜疫苗的研究, 都取得了较好的免疫效果, 但这些结果和结论能否适用于人类, 仍存在一定距离. 现在构建乳酸杆菌口服基因工程苗的表达载体的条件都已逐渐完善, 只是乳酸杆菌如何诱导小肠产生局部免疫反应的机制尚不清楚. 我们所面对的巨大挑战是如何使机体对表达任何抗原的乳酸杆菌都能产生需要的免疫应答. 我们相信有了乳酸杆菌的标记系统, 弄清乳酸杆菌如何诱导黏膜免疫反应的机制只是时间上的问题. 乳酸杆菌很有希望成为非常具有吸引力的口服基因工程苗的表达载体.

备注

电编:张敏 编辑:王瑾晖 审读:张海宁

参考文献

1.	Darji A, Guzmán CA, Gerstel B, Wachholz P, Timmis KN, Wehland J, Chakraborty T, Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell. 1997;91:765-775.  [PubMed]  [DOI]

2.	Paglia P, Medina E, Arioli I, Guzman CA, Colombo MP. Gene transfer in dendritic cells, induced by oral DNA vaccination with Salmonella typhimurium, results in protective immunity against a murine fibrosarcoma. Blood. 1998;92:3172-3176.  [PubMed]  [DOI]

3.	Shata MT, Reitz MS Jr, DeVico AL, Lewis GK, Hone DM. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. Vaccine. 2001;20:623-629.  [PubMed]  [DOI]

4.	Gentschev I, Dietrich G, Spreng S, Kolb-Mäurer A, Daniels J, Hess J, Kaufmann SH, Goebel W. Delivery of protein antigens and DNA by virulence-attenuated strains of Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes. J Biotechnol. 2000;83:19-26.  [PubMed]  [DOI]

5.	梁 雪芽, 宋 厚辉, 江 玲丽, 陈 雪燕, 方 维焕, 李 建荣. 沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中的应用. 中国兽医杂 志. 2002;38:35-37.  [PubMed]  [DOI]

6.	郭兴华主编. 益生菌基础与应用. 第1版. 北京: 北京科学技术出版社 2002; 335-339.  [PubMed]  [DOI]

7.	Havenith CEG, Seegers JF, Pouwels PH. Gut-associated lactobacilli for oral immunisation. Food Research International. 2002;35:151-163.  [PubMed]  [DOI]

8.	Kaila M, Isolauri E, Soppi E, Virtanen E, Laine S, Arvilommi H. Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhea by a human Lactobacillus strain. Pediatr Res. 1992;32:141-144.  [PubMed]  [DOI]

9.	郭本恒主编. 益生菌. 第1版. 北京: 化学工业出版社 2003; 101-104.  [PubMed]  [DOI]

10.	Thoreux K, Schmucker DL. Kefir milk enhances intestinal immunity in young but not old rats. J Nutr. 2001;131:807-812.  [PubMed]  [DOI]

11.	Novotny R, Scheberl A, Giry-Laterriere M, Messner P, Schäffer C. Gene cloning, functional expression and secretion of the S-layer protein SgsE from Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a in Lactococcus lactis. FEMS Microbiol Lett. 2005;242:27-35.  [PubMed]  [DOI]

12.	Grangette C, Müller-Alouf H, Goudercourt D, Geoffroy MC, Turneer M, Mercenier A. Mucosal immune responses and protection against tetanus toxin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillus plantarum. Infect Immun. 2001;69:1547-1553.  [PubMed]  [DOI]

13.	Sørvig E, Grönqvist S, Naterstad K, Mathiesen G, Eijsink VG, Axelsson L. Construction of vectors for inducible gene expression in Lactobacillus sakei and L plantarum. FEMS Microbiol Lett. 2003;229:119-126.  [PubMed]  [DOI]

14.	Scheppler L, Vogel M, Zuercher AW, Zuercher M, Germond JE, Miescher SM, Stadler BM. Recombinant Lactobacillus johnsonii as a mucosal vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2002;20:2913-2920.  [PubMed]  [DOI]

15.	Oliveira ML, Monedero V, Miyaji EN, Leite LC, Lee Ho P, Pérez-Martínez G. Expression of Streptococcus pneumoniae antigens, PsaA (pneumococcal surface antigen A) and PspA (pneumococcal surface protein A) by Lactobacillus casei. FEMS Microbiol Lett. 2003;227:25-31.  [PubMed]  [DOI]

16.	Pouwels PH, Leer RJ, Shaw M, Heijne den Bak-Glashouwer MJ, Tielen FD, Smit E, Martinez B, Jore J, Conway PL. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J Food Microbiol. 1998;41:155-167.  [PubMed]  [DOI]

17.	Maassen CB, van Holten-Neelen C, Balk F, den Bak-Glashouwer MJ, Leer RJ, Laman JD, Boersma WJ, Claassen E. Strain-dependent induction of cytokine profiles in the gut by orally administered Lactobacillus strains. Vaccine. 2000;18:2613-2623.  [PubMed]  [DOI]

18.

Shaw DM, Gaerthé B, Leer RJ, Van Der Stap JG, Smittenaar C, Heijne Den Bak-Glashouwer M, Thole JE, Tielen FJ, Pouwels PH, Havenith CE. Engineering the microflora to vaccinate the mucosa: serum immunoglobulin G responses and activated draining cervical lymph nodes following mucosal application of tetanus toxin fragment C-expressing lactobacilli. Immunology. 2000;100:510-518.  [PubMed]  [DOI]

19.	Reveneau N, Geoffroy MC, Locht C, Chagnaud P, Mercenier A. Comparison of the immune responses induced by local immunizations with recombinant Lactobacillus plantarum producing tetanus toxin fragment C in different cellular locations. Vaccine. 2002;20:1769-1777.  [PubMed]  [DOI]

20.	Steidler L, Robinson K, Chamberlain L, Schofield KM, Remaut E, Le Page RW, Wells JM. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect Immun. 1998;66:3183-3189.  [PubMed]  [DOI]

21.	Seegers JF. Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects. Trends Biotechnol. 2002;20:508-515.  [PubMed]  [DOI]

22.	Pérez-Arellano I, Pérez-Martínez G. Optimization of the green fluorescent protein (GFP) expression from a lactose-inducible promoter in Lactobacillus casei. FEMS Microbiol Lett. 2003;222:123-127.  [PubMed]  [DOI]

23.	Gory L, Montel MC, Zagorec M. Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus sakei in fermented meat products. FEMS Microbiol Lett. 2001;194:127-133.  [PubMed]  [DOI]

24.	Neumann NF, Gyürek LL, Gammie L, Finch GR, Belosevic M. Comparison of animal infectivity and nucleic acid staining for assessment of Cryptosporidium parvum viability in water. Appl Environ Microbiol. 2000;66:406-412.  [PubMed]  [DOI]