RNA 干扰在肝病治疗中的研究进展

摘要

RNA干扰(RNAinterference, RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA, dsRNA)引发的转录后基因静默机制, 它是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制, RNA干扰在细胞分裂过程中发挥了至关重要的控制作用, 对引导细胞形成某种特定类型的组织产生深远的影响.《科学》把这一令人激动的发现当作2002年最重大的科学突破来欢呼, 这些发现将使生物学家们重新审度细胞及其演化过程. 目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究, RNA干扰有可能成为包括病毒感染在内的许多肝病的一种有效治疗手段, 并有可能为肿瘤基因治疗提供新策略.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: August 10, 2005
Revised: August 20, 2005
Accepted: August 26, 2005
Published online: September 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

RNA干扰( RNA interference, RNAi)最早发现在线虫类秀丽隐杆线虫, 反应于双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA), 使目标mRNA以序列特异性的退化, 是一种具有序列特异性的RNA依赖性转录后基因沉默现象(posttranscriptional gene silencing, PTGS)[1]. RNAi 广泛存在于从真菌到植物, 从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中. RNAi的表现形式是多种多样的, 除动物中的RNAi外, 还包括在植物中的PTGS、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性, 真菌的抑制(quelling)现象等.

RNAi最核心的生物学功能在于它能监控异常的或外源的遗传物质在机体内的水平, 调控基因的表达. 利用dsRNA可以特异性地降解与之有同源序列的mRNA, 从而特异性的阻断相应基因的表达. 因此, RNAi被认为是真核生物的遗传监视器[2]和基因组水平的免疫系统[3]. 目前, RNAi技术已被广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定、信号传导研究及基因治疗[4,5]等方面, 显示了非常广阔的应用前景.

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)所导致的慢性肝炎、肝癌是严重危害人类健康的疾病. 目前, 慢性乙型肝炎的治疗主要是用干扰素(IFN)和拉米夫定, 治疗丙型肝炎感染的主要是干扰素和利巴韦林联用, 其效果均不很理想. 肝癌作为一种恶性肿瘤更是缺乏有效的治疗方法. siRNA技术经研究发现可用于肝病抗病毒和肿瘤的治疗[6-11], 以下就近期的研究进展进行综述.

1 RNAi的作用的机制

RNAi作用过程可分为启动过程和效应过程. 启动过程中, 外源性dsRNA被Dicer(RNaseIII家族中的dsRNA2特异性核糖核酸酶)以一种ATP依赖的方式降解为19-21 bp的双链siRNAs, 后者被称为"向导RNA". 效应过程中, siRNAs结合siRNA2核糖核蛋白复合体(siRNP)形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)[12]. 活化的RISC遵循碱基配对原则靶向性与同源mRNA结合并导致其降解, 从而使得内源基因不能表达, 导致内源基因的沉默[4,13,14]. 切断后的mRNA或者被核酸外切酶降解, 或者可能成为异常RNA, 在RNA依赖多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)的作用下又形成了新的dsRNA进一步作用于另外的靶向mRNA. 这种不断被放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA, 使RNAi在短时间内达到迅速, 有效地抑制mRNA翻译形成蛋白或多肽, 从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的形成.

2 RNAi的作用特征

RNAi的作用特征主要有: (1)RNAi具有高度的特异性. 单个碱基改变就可能使RNAi失效, RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA, 而其他mRNA的表达则不受影响[15]. (2)RNAi存在放大效应: ① 长的dsRNA被Dicer酶裂解成的每个初级siRNA, 都具有结合一个同源mRNA的能力, 此步放大效应约10-20倍. ② RISC复合物中, 在RdRP酶的作用下, 经类PCR合成的mRNA互补链也形成了dsRNA, 再被酶裂解成次级siRNA. 这样细胞内的siRNA数量大大增加, 显著增强干扰作用. ③以上生成的siRNA可多次重复应用, 进一步提高了其放大作用[4,15], 这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的. (3)RNAi效应具有高效性. 无论是在体内还是体外实验中, 仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达, 抑制的效率在低等动物中>90% [16]. 且siRNA作为RNAi的中介分子, 通过序列互补配对法则特异性降解目的基因 [17,18]. (4)RNAi需要ATP参与其效应. 在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程, 可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量[19]. (5)RNAi作用广泛并可遗传. 基因表达的效应可以跨越细胞界限, 在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持, 并可传递给子一代.

3 RNAi的生物学功能

随着对RNAi的大量深入研究, 人们逐步认识到RNAi与获得性免疫反应一样具有特异性、多样性、记忆性、可遗传性等特征. 目前认为RNAi的本质是一种由RNA介导的序列特异性的获得性免疫反应, 是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制, 是生物体在基因组水平上的免疫系统[20].RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫, 维持基因组中转座子的稳定性, 清除异常RNA, 同时参与基因表达的调控.

4 RNAi在肝病治疗中的应用

siRNA的这种生物学作用使它具有潜在的临床应用价值, 可发展为高度特异的性的基因封闭治疗手段, 具有极诱人的前景. siRNA正在被用于包括肝癌的多种疾病的广泛研究, 并初步取得成果.

4.1 RNAi对HBV的抑制

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于肝DNA病毒属家族. 虽然在有些时候疫苗对于肝炎的治疗和预防是有效的, 但是具调查, 全世界约有一百万的人死于HBV相关疾病. 许多慢性转染HBV病毒的患者随后发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[21]. 现在, 已知的至少有两种正对慢性肝炎的抗病毒疗法, 一种是α-干扰素, 另一种为包括拉米夫定(3TC 3-硫胞苷), 阿德福韦, 恩替卡韦的核苷类似物. 虽然这些方法成功的减少了病毒的载量但是效果不令人满意. 用RNA干扰技术就成了一个吸引人的选择. 在以下的最近各项研究中证明了它对HBV表达的有效抑制.

Qian et al[22],在体外构成包括t7和tac启动子的表达载体. 目的cDNA片断被克隆到该载体相对的启动子之间. 在大肠杆菌中dsRNA被载体表达, 并通过亲和色普法纯化. 然后在含锰离子的缓冲溶液中被核糖核酸酶Ш降解, 后用15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离, siRNA(大约25 bp)便可以得到. siRNA通过克隆, 发酵, 消化, 提纯, 与靶基因表达质粒共转染入人细胞系. 结果表明siRNA特异性的与乙肝病毒聚合酶部分相对应, 并特异性的抑制病毒蛋白的表达. HBsAg表达水平下降了10%.对HBsAg和HBeAg表达抑制的剂量依赖效应于HepG2细胞被观察到. 在转染7.5 nmol／L si HBV p后的6d抑制率持续于70%左右的最高水平. Moore et al[23],在体外试验中首先鉴别出有效抑制乙肝表面抗原的RNA干扰序列, 并证明它使由聚合酶Ш表达盒表达. 该表达盒被插入不同的两个载体, 原型的泡沫状病毒(PFV)和腺伴随病毒(AAV).它们的共同点是都是非致病的, 并且有整合入细胞DNA的能力. 包含HBV目的RNA干扰分子的载体被引入293 t(一种稳定表达乙肝表面抗原的细胞),载体也被在HepG2.2.15细胞(一种分泌有传染性的HBV病毒粒子的细胞)中评估. 7 d后HBVAg的敲低率于对照相比高达90%.Chen et al[24]在该试验表明合成的siRNA作用于HBV的c基因和s基因, 可以有效的特异的抑制乙肝病毒和抗原的表达. HBsAg和HBeAg以及HBV的表达可以被siRNA被抑制呈剂量反应关系. 此外, 该试验表明在相同终浓度的情况下siRNA的联合体作用于多个区域, 抑制HBV表达的效果优于单个siRNA. 在siRNA处理后未观察到细胞调亡的变化. 得出试验结论为, 在细胞体外培养中, siRNA有明显的抑制HBV和抗原表达的作用, 而且siRNA作用于不同的区域展现了其潜力. Yang et al[25]用荧光激活细胞分选术. 发现siRNA作用于HBsAg减少了绿色荧光蛋白信号56%与对照组相比. 实时PCR表明乙型肝炎表明绿色荧光蛋白mRNA提取于与pAVU6+27共转染的HepG2细胞, 并且与空的媒介防除相比乙型肝炎表明绿色荧光蛋白质粒的表达减少了90%. HBsAg和HBeAg的表达同样被分别抑制了43%和64%. 从而得出试验结论siRNA表达载体可以抑制HBsAg的表达并且提供了新的有效途经筛选siRNA. Uprichard et al[26]该试验通过腺病毒重组体在HBV转基因小鼠的肝脏表达HBV特异siRNA, 抑制预成HBV基因的表达和复制在至少26d.Zhu et al[27]用HepG2 2.2.15作为靶细胞, 质粒和微脂体共转染入培养细胞, HBV DNA经过PCR检测, HBV c－mRNA被半定量PCR检测到. 试验表明质粒成功的表达了siRNA, 两个构建的siRNA有效的抑制了HBV的表达, 并且它对HBV的抑制作用存在反应关系.

4.2 RNAi对HCV的抑制

HCV为单股正链RNA病毒, 在肝细胞中直径为37-40 nm. 现今没有有效治疗HCV的疫苗. 现在流行的受人们欢迎的治疗HCV感染的方法是peg干扰素联合病毒唑. 最近经限制性临床试验证明ns3蛋白酶的小分子抑制子比peg干扰素和病毒唑的效果更好. 但是现在将其用于标准疗法治疗HCV感染还为时过早. 因为HCV病毒是RAN病毒, 既能当作病毒mRAN进行蛋白翻译, 又可作为模板经性病毒复制, 因此成为RAN干扰研究的理想模型.

Takigawa et al[28]在此试验中他们用了两种方法表达siRNA, 一个是表达质粒(Pavu6+27),另一个是包含Pavu6＋27衍生表达盒的慢病毒重组体. Gomez et al[29]在试验中观察了HCV RNA基因组的三性从基本序列到三级结构, 它说明了RNA为基础治疗的限制和可能性. 并描述了一些以RNA为基础的抗HCV的方法. 虽然5－utr曾经被认为是最适合治疗性siRNA或siRNA的区域, 因为它是极端保守的序列. 他们观察到经过siRNA对5－utr的抑制, HCV亚基因组的表达只有微弱的抑制. 在质粒和慢病毒介导的表达系统中, siRNA通过对ns3－1和ns5b的抑制使在在没有抑制宿主细胞基因的情况下, 更为有效的抑制HCV的表达. 合成的siRNA通过对ns3－1的作用也可以有效的抑制HCV的表达, 并存在剂量反应关系. Randall et al[30], 在该试验中证明了siRNA治疗HCV的潜在可能性, 但是仍然存在不确定性. Kronke et al[31]因为以siRNA为基础的基因治疗的最大困难是HCV有许多高度不同的基因型并且快速出现新的种型. 为了这个原因, 他们用可选择的策略克服它. 在一种方法中, 使用核糖核酸内切酶修饰过的siRNA(esiRNA)同时多位点处理病毒基因组. 在该试验中他们发现esiRNA直接抑制除 5‵非编码区(5‵ntr)的HCV编码序列的多个区域, 从而有效的抑制了HCV基因组和亚基因组的表达. 在另一可供选择的方法中, 利用逆转录病毒的产生的假模标本编码小发卡结构RNA (siRNA). Seong et al[32] 因为prk2是NS5B磷酸化和HCV表达所必须的, 所以用siRNA敲低prk2的表达便可干扰HCV RNA的表达. Jong et al[33]在该试验的体内试验和体外试验的数据强有力的指出NSAP1蛋白增加HCV ires依赖翻译通过在HCV Mrna编码区预acr相互作用. Wilson et al[20]通过电穿孔(electroporation)基因转移方法降被设计成靶向HCV基因组的双链小干扰RNA(siRNA)分子导入含有HCV亚基因组复制子的人肝细胞瘤细胞系(huh7)细胞中, 显示两种siRNA均可明显降低病毒特异性蛋白的表达和RNA合成, 其水平较未用siRNA处理的细胞低90%, 这两种siRNA还能保护原始的huh7细胞免受HCV复制子RNA的实验感染. Randal et al[34]发现siRNA对HCV RNAs封闭为剂量依赖性和序列依赖性. 靶序列内有3nt不同的2细胞株HCV变异只能被各自同源序列的siRNA所封闭, 这种序列特异性证实HCV抗原表达的下降不是双链siRNA非特异性激活ifn系统所致, 而且经siRNA治疗后HCV RNA水平下降, 转染后4d HCV RNA水平降低了80倍, 导入siRNA后是受HCV RNA感染的细胞数降低了98﹪以上.

4.3 RNAi在肝癌治疗中的应用

肝细胞癌(HCC)的发生与一些致癌基因的过渡表达有关. 在70%的HCCs中c-myc呈过渡表达. Cheng et al[35],在该试验中通过真核生物生存素基因rna干扰表达载体和与生存素基因结合的重组质粒(pSuNeo－SVV), pSupperssorNeo (pSuNeo)被消化酶Xba I和Sa I及特异的双链RNAi引物处理. 大鼠肝癌细胞系SMMC-7721辅助细胞模型在用siRNA处理后用大鼠肝癌细胞系SMMC-7721转染细胞处理. 用免疫组化染色法和逆转录酶PCR检测大鼠肝癌细胞系细胞表面生存素基因. 流式细胞计量术用于细胞周期的分析. 透射电子显微术检测是否有RNAi处理细胞编程性死亡. 结果发现通过siRNA的处理几乎未检测到生存素基因在SMMC-7721细胞表面的表达. 凋亡指数上升了15.6%. 并且细胞数量在G2/M期减少, 细胞生长被抑制. 从而得除结论siRNA可以敲低生存素基因的表达, 诱导调亡和抑制肝癌细胞的生长. Xu et al[36]在试验中发现细胞被psilencer-c-myc转染后c-myc Mrna和蛋白的表达被抑制且与模拟转染细胞相比抑制率高达67%. 在被转染的HepG2细胞中可以检测到细胞的调亡. 从而得出结论c-myc在转录子的表达和在siRNA转染的HepG2细胞中的翻译水平明显被抑制. Liu et al[37]在该试验中哺乳动物中siRNA表达载体被成功构建, 并且与对照组相比, 表达siRNA的pUC18U6 HBV抗HBV减少HBsAg的浓度值得注目的减少了44% (P < 0.05).

5 结语

siRNA在体外(细胞培养)和体内(小鼠模型)试验性抗病毒感染, 调节机体基因表达的研究中已取得了迅速进展. 虽然这些研究还相当初步, 但明显提示siRNA有可能成为包括病毒感染在内的许多肝病的一种有效治疗手段. 同时, siRNA也有助于我们重新认识慢性病毒感染的机制. 相信随着siRNA研究的进展和对其认识的提高, 必将对肝病的防治产生巨大的影响.

备注

电编:李琪 编辑:张海宁

参考文献

1.	Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391:806-811.  [PubMed]  [DOI]

2.	Bosher JM, Labouesse M. RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol. 2000;2:E31-E36.  [PubMed]  [DOI]

3.	Plasterk RH. RNA silencing: the genome's immune system. Science. 2002;296:1263-1265.  [PubMed]  [DOI]

4.	Hannon GJ. RNA interference. Nature. 2002;418:244-251.  [PubMed]  [DOI]

5.	McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 2002;3:737-747.  [PubMed]  [DOI]

6.	Klein C, Bock CT, Wedemeyer H, Wüstefeld T, Locarnini S, Dienes HP, Kubicka S, Manns MP, Trautwein C. Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA. Gastroenterology. 2003;125:9-18.  [PubMed]  [DOI]

7.	Konishi M, Wu CH, Wu GY. Inhibition of HBV replication by siRNA in a stable HBV-producing cell line. Hepatology. 2003;38:842-850.  [PubMed]  [DOI]

8.	McCaffrey AP, Nakai H, Pandey K, Huang Z, Salazar FH, Xu H, Wieland SF, Marion PL, Kay MA. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 2003;21:639-644.  [PubMed]  [DOI]

9.	Shlomai A, Shaul Y. Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference. Hepatology. 2003;37:764-770.  [PubMed]  [DOI]

10.	Wu J, Nandamuri KM. Inhibition of hepatitis viral replication by siRNA. Expert Opin Biol Ther. 2004;4:1649-1659.  [PubMed]  [DOI]

11.	Zhang XN, Xiong W, Wang JD, Hu YW, Xiang L, Yuan ZH. siRNA-mediated inhibition of HBV replication and expression. World J Gastroenterol. 2004;10:2967-2971.  [PubMed]  [DOI]

12.	Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 2003;67:657-685.  [PubMed]  [DOI]

13.	Cerutti H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions? Trends Genet. 2003;19:39-46.  [PubMed]  [DOI]

14.	Mourrain P, Béclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel JB, Jouette D, Lacombe AM, Nikic S, Picault N. Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell. 2000;101:533-542.  [PubMed]  [DOI]

15.	Elbashir SM, Harborth J, Weber K, Tuschl T. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods. 2002;26:199-213.  [PubMed]  [DOI]

16.	Davenport RJ. Gene silencing. A faster way to shut down genes. Science. 2001;292:1469-1471.  [PubMed]  [DOI]

17.	Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 2000;101:25-33.  [PubMed]  [DOI]

18.	Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001;15:188-200.  [PubMed]  [DOI]

19.	Nykänen A, Haley B, Zamore PD. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell. 2001;107:309-321.  [PubMed]  [DOI]

20.

Wilson JA, Jayasena S, Khvorova A, Sabatinos S, Rodrigue-Gervais IG, Arya S, Sarangi F, Harris-Brandts M, Beaulieu S, Richardson CD. RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:2783-2788.  [PubMed]  [DOI]

21.	Ganem D, Varmus HE. The molecular biology of the hepatitis B viruses. Annu Rev Biochem. 1987;56:651-693.  [PubMed]  [DOI]

22.	Qian ZK, Xuan BQ, Min TS, Xu JF, Li L, Huang WD. Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells. World J Gastroenterol. 2005;11:1297-1302.  [PubMed]  [DOI]

23.	Moore MD, McGarvey MJ, Russell RA, Cullen BR, McClure MO. Stable inhibition of hepatitis B virus proteins by small interfering RNA expressed from viral vectors. J Gene Med. 2005;7:918-925.  [PubMed]  [DOI]

24.	Chen Z, Xu ZF, Ye JJ, Yao HP, Zheng S, Ding JY. Combination of small interfering RNAs mediates greater inhibition of human hepatitis B virus replication and antigen expression. J Zhejiang Univ Sci B. 2005;6:236-241.  [PubMed]  [DOI]

25.	Yang ZG, Chen Z, Ni Q, Xu N, Shao JB, Yao HP. Inhibition of hepatitis B virus surface antigen expression by small hairpin RNA in vitro. World J Gastroenterol. 2005;11:498-502.  [PubMed]  [DOI]

26.	Uprichard SL, Boyd B, Althage A, Chisari FV. Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs. Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:773-778.  [PubMed]  [DOI]

27.	Zhu C, Fan XG, Li N, Ying RS. [Inhibition of hepatitis B virus replication by RNA interference in vitro]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2004;12:522-525.  [PubMed]  [DOI]

28.	Takigawa Y, Nagano-Fujii M, Deng L, Hidajat R, Tanaka M, Mizuta H, Hotta H. Suppression of hepatitis C virus replicon by RNA interference directed against the NS3 and NS5B regions of the viral genome. Microbiol Immunol. 2004;48:591-598.  [PubMed]  [DOI]

29.	Gómez J, Nadal A, Sabariegos R, Beguiristain N, Martell M, Piron M. Three properties of the hepatitis C virus RNA genome related to antiviral strategies based on RNA-therapeutics: variability, structural conformation and tRNA mimicry. Curr Pharm Des. 2004;10:3741-3756.  [PubMed]  [DOI]

30.	Randall G, Rice CM. Interfering with hepatitis C virus RNA replication. Virus Res. 2004;102:19-25.  [PubMed]  [DOI]

31.	Krönke J, Kittler R, Buchholz F, Windisch MP, Pietschmann T, Bartenschlager R, Frese M. Alternative approaches for efficient inhibition of hepatitis C virus RNA replication by small interfering RNAs. J Virol. 2004;78:3436-3446.  [PubMed]  [DOI]

32.	Kim SJ, Kim JH, Kim YG, Lim HS, Oh JW. Protein kinase C-related kinase 2 regulates hepatitis C virus RNA polymerase function by phosphorylation. J Biol Chem. 2004;279:50031-50041.  [PubMed]  [DOI]

33.	Kim JH, Paek KY, Ha SH, Cho S, Choi K, Kim CS, Ryu SH, Jang SK. A cellular RNA-binding protein enhances internal ribosomal entry site-dependent translation through an interaction downstream of the hepatitis C virus polyprotein initiation codon. Mol Cell Biol. 2004;24:7878-7890.  [PubMed]  [DOI]

34.	Randall G, Grakoui A, Rice CM. Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:235-240.  [PubMed]  [DOI]

35.	Cheng SQ, Wang WL, Yan W, Li QL, Wang L, Wang WY. Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721. World J Gastroenterol. 2005;11:756-759.  [PubMed]  [DOI]

36.	Xu Y, Wang YH, Gao JD, Ye J, Zhu HX, Xu NZ, Wang XY, Sun ZT. [Suppression of c-myc expression by interference RNA in HepG2 hepatocellular carcinoma cells]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2004;26:458-460.  [PubMed]  [DOI]

37.	Liu J, Guo Y, Xue CF, Li YH, Huang YX, Ding J, Gong WD, Zhao Y. Effect of vector-expressed siRNA on HBV replication in hepatoblastoma cells. World J Gastroenterol. 2004;10:1898-1901.  [PubMed]  [DOI]