HMGCR基因多态性与乙型病毒性肝炎关联分析

摘要

目的: 探讨HBV感染临床转归与HMGCR基因多态性的关系.

方法: 2002-02/2004-02无亲缘关系的重庆地区肝病患者2 400人, 采用聚合酶链反应(PCR)及限制性内切酶技术检测HMGCR基因20外显子18109T/C位点多态性, 应用SPSS软件χ²检验以及非条件Logistic回归统计学处理方法.

结果: Hardy-Weinberg平衡检验P>0.01(P = 0.016), 拟合度优良；以非条件Logistic回归校正年龄及性别因素进行分析, 结果发现慢性乙型肝炎(CHB)、重型肝炎(SHB)、肝硬化(LC)患者与乙肝病毒携带者(AsC)相比, 其基因型和等位基因频率有显著差别(P<0.01), 在共显性模式下HMGCR 18109T/C SNP与HBV感染后携带状态显著关联(LC/AsC: OR = 0.676, P = 0.004; AsC/SHB: OR = 0.672, P = 0.000; AsC/CHB: OR = 0.747; P = 0.000; AsC/CHB+SHB+LC: OR = 0.756, P = 0.010), 与T/T和C/T相比, C/C基因型个体在HBV感染后转为无症状携带者的易感性显著增高.

结论: Hardy-Weinberg平衡拟合度检验优良, 说明所收集人群具有良好的代表性；其次首次证实HMGCR基因20外显子18109T/C多态性与慢性乙型肝炎有关联存在.

关键词: HMGCR基因；多态性；乙型病毒性肝炎

Relationship between polymorphisms of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene and hepatitis B virus infection

Chun-Qing Deng, Guo-Hong Deng, Yu-Ming Wang

Chun-Qing Deng, Guo-Hong Deng, Yu-Ming Wang, Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, the Third Military Medical University Chinese PLA , Chongqing 400038, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30200234.

Correspondence to: Yu-Ming Wang, Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, the Third Military Medical University Chinese PLA, 30 Gaotanyan Zhengjie, Chongqing 400038, China. wym417@mail.tmmu.com.cn

Received: April 4, 2005
Revised: April 7, 2005
Accepted: April 9, 2005
Published online: September 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the relationship between exon20 polymorphism of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) gene and clinical outcome of the patients infected with hepatitis B virus (HBV).

METHODS: From the year 2002 to 2004 in Chongqing, the clinical data and blood samples of 2 400 patients with liver diseases were collected. The total DNA was extracted from the blood samples. After amplification, the exon20 polymorphisms of HMGCR gene (locus 18109T/C) were detected polymerase chain reaction (PCR), digestion of restriction enzyme and gel electrophresis.

RESULTS: A total of 1 354 patients were diagnosed with hepatitis B. Hardy-Weinberg equillibrum test showed a favorable goodness for fit (P = 0.016>0.01). Significant differences of genotypes and allele frequency existed between the asymptomatic carriers (AsCs) and patients of any other subgroup except acute hepatitis B and liver cancer (P <0.01). Under the condition of codominance, the polymorphism of HMGCR 18109T/C was significantly correlated with the status of patients after HBV infection (liver cirrhosis/AsC: OR = 0.676, P = 0.004; AsC/severe hepatitis B: OR = 0.672, P = 0.000; AsC/chronic hepatitis B: OR = 0.747, P = 0.000; AsC/chronic hepatitis B+severe hepatitis B+liver cirrhosis: OR = 0.756, P = 0.010), and patients with C/C genotype tended to become AsCs more easily after HBV infection, as compared with patients with T/T and C/T genotype.

CONCLUSION: The exon20 (locus 18109T/C) polymorphism of HMGCR gene is correlated with HBV infection, and patients with C/C genotype are more succeptible to become AsCs after HBV infection.

Key Words: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene; Polymorphism; Viral hepatitis B

0 引言

中国是乙型病毒性肝炎高发区, HBV感染慢性化程度较高, 与肝硬化和肝癌的发生关系密切, 部分尚可转变为重型肝炎, 因此有关其发病机制倍受关注.已有研究发现即使相同的病毒分离株在感染不同的宿主时, 临床表现亦会有很大差异, 故而遗传因素可能为重要原因.单核苷酸多态性(SNP)作为第三代基因遗传标记构成了不同个体与群体对疾病易感性的遗传学基础, 与乙型肝炎有关的基因多态性的研究正在国内悄然兴起[1,2].3羟基3甲基戊二酸辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)是肝脏胆固醇合成的限速酶, 其抑制剂在临床上被广泛用于治疗高胆固醇血症.除降低胆固醇的作用外, 其抑制剂的使用可显著减轻缺血再灌注鼠的肝损伤[3], 这与其提高血管内皮细胞中的eNOS的表达及活化功能是一致的, 因eNOS对肝脏具保护作用早已证实[4].另有报道HMGCR抑制剂对鼠有肝切除和肝移植后的肝脏保护作用[5].关于其多态性的研究目前很少, 仅发现与低胆固醇血症者易于自杀有关[6].虽然HMGCR抑制剂与不同肝病的关系报道很多, 但有关HMGCR基因本身与不同肝病的关系报道很少, 到底HMGCR基因与HBV感染之间有无关系, 初探如下.

1 材料和方法

1.1 材料

2002-02/2004-02诊治的无亲缘关系的重庆地区汉族居民2 400例, 男2 002例, 女398例, 年龄2-72岁.样本收集的同时填写详细的流行病学资料及临床资料录入计算机, 乙型肝炎诊断采用2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订"病毒性肝炎防治方案"制定的标准, 采集标本获得患者的知情同意.

1.2 方法

晨取静脉血5 mL, EDTA抗凝, 改良Miller法抽提人全血DNA[7], 所抽提DNA加水稀释至终浓度5-10 mg/L制成分型所用96孔DNA模板；参考GenBank已有的注释对基因进行注释, 选择HMGCR基因等位基因变异频率较高的20外显子18109T/C位点研究.应用聚和酶链反应(PCR)及限制性酶切方法判定基因型, 应用primer premier 5.0软件设计引物、酶切位点, 所设引物(由北京奥科有限公司合成)如下: Sense 5'-3'tct ttc aga gag gtc tca ggt tc Anti-sense 5'-3'aat cca ttt tca act ggc cgg, 内切酶Nci Ⅰ(NEB公司)识别位点为cc/sgg.PCR反应条件95℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 72℃延迟5 min, 循环次数30次.PCR及酶切产物分别以10 g/L及2 g/L琼脂糖凝胶电泳, 基因型的确定依酶切后凝胶电泳的片段判定, 送北京鼎国生物公司测序验证.

统计学处理 采用SPSS统计软件处理, 等位基因直接由基因型计算, Hardy-Weinberg平衡以及两组间的差异用列联表χ²检验, 以非条件Logistic回归校正年龄及性别因素进行分层分析.以P＞0.01视为Hardy-Weinberg平衡检验优良；P<0.01视为两组间有统计学差异.

2 结果

2.1 HMGCR(18109T/C)基因型的判定

依酶切后凝胶电泳片段判定基因型如下: TT: 252 bp；CT: 252 bp, 20 bp, 232 bp；CC: 20 bp, 232 bp(图1).北京鼎国生物公司测序报告(图2)验证依酶切片段判定基因型正确无误.

图1 HMGCR(18109T/C)基因型的判定. A: 1: TT；2: CC；3: CT；4: TT；5: DL2000 marker；B: 96孔模板基因型. M: DL2000 marker.

图2 HMGCR(18109T/C)基因型测序报告. A: CC; B: TT; C: CT.

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析

诊断明确的乙型肝炎患者总计1354例, Hardy-Weinberg平衡分析P＞0.01(P = 0.016), 检验优良；乙肝病毒携带与慢乙肝两组之间等位基因频率相比P<0.01, 乙肝病毒携带与慢乙肝+肝硬化+重症肝炎组之间等位基因频率相比P<0.01, 均有显著性差异(表1).

表1 HBV感染后不同临床转归HMGCR 18109T/C基因型及等位基因.

分组	n	性别M/F	年龄x(s)	基因型			等位基因(%)
				CC	CT	TT	C	T
AsC	192	109/83	34.787(11.291)	58	78	56	50.52	49.48
AHB	10	8/2	30.253(10.244)	3	2	5
CHB	837	653/184	34.311(11.561)	193	307	337	41.40	58.40
SHB	139	113/26	39.989(11.811)	31	52	56	41.01	58.99
LC	157	126/31	41.964(11.441)	40	60	57	44.59	55.41
HCC	19	13/6	49.263(12.253)	5	7	7
LC+SHB	296	239/57	40.325(11.589)	71	112	113	42.91	57.09
CHB+AsC	1029	762/267	34.648(11.207)	251	385	393	43.10	56.90
LC+CHB+SHB	1133	892/241	35.597(10.207)	264	419	450	41.79	58.21

AsC: 乙肝病毒携带, CHB: 慢乙肝, LC: 肝硬化, SHB: 重症肝炎, AHB: 急乙肝, HCC: 肝癌, P<0.01 vs AsC.

2.3 非条件Logistic回归分析

为避免所收病例各组之间年龄或性别的差异, 有必要以非条件Logistic回归校正年龄及性别因素后进一步关联分析, 结果发现在共显性模式下HMGCR 18109T/C SNP与HBV感染后携带状态显著关联, 与T/T和C/T相比, C/C基因型个体在HBV感染后转为无症状携带者的易感性显著增高(表2, 共显性模式: OR = 0.756, 95% CI = 0.611-0.937).

表2 HMGCR 18109T/C SNP与HBV感染关联的分层分析.

分层	显性模式		隐性模式		共显性模式
	P	OR(95%CI)	P	OR(95%CI)	P	OR(95%CI)
LC/CHB	0.354	0.823(0.545-1.242)	0.415	0.859(0.595-1.239)	0.205	1.150(0.926-1.429)
LC/SHB	0.578	0.858(0.499-1.474)	0.608	0.883(0.549-1.420)	0.399	1.108(0.873-1.406)
LC/AsC	0.051	1.898(0.997-3.610)	0.068	1.739(0.960-3.149)	0.004	0.676(0.517-0.884)
AsC/SHB	0.080	1.773(0.934-3.367)	0.064	1.739(0.967-3.125)	0.000	0.672(0.554-0.817)
AsC/CHB	0.070	1.414(0.973-2.057)	0.014	1.579(1.096-2.275)	0.000	0.747(0.662-0.844)
SHB/CHB	0.770	1.068(0.687-1.660)	0.890	1.027(0.706-1.494)	0.739	0.976(0.845-1.126)
AsC+CHB/LC+SHB	0.773	0.954(0.693-1.314)	0.909	0.984(0.743-1.303)	0.653	1.038(0.882-1.223)
AsC/CHB+SHB+LC	0.066	1.413(0.977-2.045)	0.013	1.583(1.103-2.272)	0.010	0.756(0.611-0.937)

AsC: 乙肝病毒携带, CHB: 慢乙肝, LC: 肝硬化, SHB: 重症肝炎, 显性模式: TT+TC/CC, 隐性模式: TT/TC+CC, 共显性模式: TT/TC/CC, 所有P值及OR均由非条件Logistic回归分析所得.

3 讨论

胆固醇及HMGCR影响肝脏的功能, 而HMGCR是胆固醇合成的关键酶, 近期研究表明HMGCR抑制剂的使用可明显改善部分肝切除后的肝脏功能[5], 也有研究认为其抑制剂的使用有时反而诱导HMGCR的活性, 刺激和激发了肝脏的再生[8], 尽管结论不一, 但毫无疑问, HMGCR与肝脏有着极为密切的关系.目前乙型肝炎等复杂性状疾病遗传易感性的研究方法有很多, 关联研究为其中一种.进行疾病关联研究需要大样本同时应避免因群体混杂而出现虚假阳性关联.我们收集样本的同时填写详尽的流行病学资料录入电脑, 排除同一患者多次化验导致所收标本重复的可能.作为HBV感染率很高的中国, 我们收集的样本量之大是其它疾病无法比拟也是其它国家无法想象的.本研究表明, 首先样本Hardy-Weinberg平衡检验P＞0.01, 拟合度检验优良, 说明收集样本人群具有良好的代表性；其次首次证实HMGCR基因20外显子18109T/C多态性与HBV感染之间存在关联: 乙肝病毒携带与HBV感染临床转归其余组之间等位频率存在显著性差异；以非条件Logistic回归校正年龄及性别因素进行分析发现在共显性模式下HMGCR 18109T/C SNP与HBV感染后携带状态显著关联, 与T/T和C/T基因型相比, C/C基因型个体在HBV感染后转为无症状携带者的易感性显著增高.由于所收集样本急性乙型肝炎以及肝癌例数太少未纳入分析, 有待以后扩大样本另行研究.我们的实验首次证实HMGCR基因本身与HBV感染有关, 至于HMGCR基因20外显子18109T/C SNP对其功能的影响还有待后续进一步研究证实.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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