修回日期: 2005-06-10
接受日期: 2005-06-13
在线出版日期: 2005-08-28
G1/S检测点是细胞增殖的关键步骤, 细胞在该点对DNA损伤、各类信号传导因子等复杂的细胞内外信号进行整合和传递, 决定细胞是否进行分裂或发生凋亡.G1/S检测点的调控涉及到正性调控子(如CDK-cyclins和E2Fs)与负性调控子(如CDKIs)间相互作用, 蛋白质泛素化、CDC25、信号转导系统等对其调控也至关重要.以下针对G1/S检测点调控机制研究的最新进展作一综述.
引文著录: 童锦禄, 冉志华. G1/S检测点调控机制研究进展. 世界华人消化杂志 2005; 13(16): 2036-2039
Revised: June 10, 2005
Accepted: June 13, 2005
Published online: August 28, 2005
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(16): 2036-2039
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i16/2036.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i16.2036
细胞周期依其形态学和生化改变主要分为两期: M(mitosis)期-染色体分离, S(synthesis)期-DNA被复制.这两期被所谓的G(gap)间隙期分隔: G1期又称DNA合成前期, 位于S期之前, 是细胞增殖的关键时相; 而G2期为DNA合成后期, 位于M期之前[1].检测点(checkpoint)又称关卡, 是在细胞周期的暂停中允许编辑和修复遗传信息, 并使每个子细胞接受与亲代细胞相同的整套遗传信息.其中G1/S检测点又是细胞增殖的关键步骤.
细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)结合形成异二聚体, 并使该酶具有活性.G1-cyclins包括cyclinE1/2、cyclinD1/2/3、cyclinA; 而CDKS包括CDK2/4/6.
cyclinD是G1进程的关键调控因子之一, cyclinD与CDK4/6形成复合体, cyclinD-CDK4/6轻度磷酸化pRb, 使组蛋白脱乙酰酶从DNA-CDK4/6结合体中释放, 并募集SWI/SWF家族成员至含pRb的染色质以重构复合体, 使某种Rb沉默基因适度转录激活, 但其他E2F-Rb调节的基因仍被抑制[2].Kahl et al[3]发现在人二倍体成纤维细胞, 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅰ(Ca/Calmodulin-depdent protein kinaseⅠ, CaMKⅠ)的活性为G1进程cyclinD-CDK4复合体激活所必需.cyclinD的诱导表达为生长因子依赖性, 并在转录、蛋白表达和细胞内定位等多水平调控.其他转录因子如NF-κB、Egr-1、ets、c-jun、CREB和核内受体等被发现能反式激活cyclinD启动子; 其他转录因子如JunB抑制cyclinD启动子激活, E2F-1通过形成E2F-1-SP1复合体抑制其活性, INI1/hSNF5直接募集至cyclinD1启动子.Tetsu et al[4]发现β-catenin通过cyclinD1基因启动子内TCF结合位点来激活cyclinD1转录, 具有活性的Ras通过启动子内Ets-和CREB-结合位点的独立信号, 更进一步激活cyclinD1.文献[5]报道在胎儿肝细胞中stat3的激活对于cyclinD1/2的下调是必要的, 并且发现在胎儿肝细胞stat3基本活性形式stat3-c抑制cyclinD1的转录, 而在肝肿瘤细胞株huH7和HepG2却激活转录.
cyclinE与CDK2结合成复合物, 调控细胞从G1期进入S期.在晚G1期, cyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2进一步磷酸化Rb成高磷酸化状态, Rb完全释放E2F转录因子.E2F又激活一系列有关DNA合成复制的基因, 同时也激活cyclinE、cyclinA1和cyclinB的转录.cyclinE转录又通过磷酸化Rb进一步激活E2F, 这一正反馈使得在限制点不可抑性地进入S期.一般都认为pRb失活涉及cyclinE与cyclinD的时序性磷酸化, 但Keenan et al[6]发现不需要cyclinD/CDK4的先期作用, cyclinE/CDK2也能磷酸化pRb, 激活E2F.最近Matsumoto et al[7]从cyclinE中确定了一段20个氨基酸的序列作为中心体定位信号(centrosomal localization signal, CLS), CLS对于靶向中心体和促进DNA合成都是必要的, CLS肽定位于中心体, 阻止内源性cyclin E 和cyclin A结合于中心体, 从而抑制DNA合成, 而异位cyclin E不能结合CDK2突变体.这些都说明了cyclin E含有中心体靶向调节区, 该区对以非依赖性CDK2形式进入S期是必要的.Ekholm-Reed et al[8]通过腺病毒转导cyclinE的异位高表达发现cyclinE能阻碍PreRC组装, 导致复制起始及可能的复制叉移动缺陷.
CDKIS包括CIP/KIP与INK4两大家族, 可抑制CDK/cyclins复合物的活性, 负性调节细胞进程.作用机制是与周期蛋白竞争结合CDK, 并使其催化亚单位失活.
包括P21(WAF/CIF1)、P27(KIP1)、P57(KIP2)三个成员, CIP/KIP家族具有广泛的抑制作用, 为浓度依赖性, 结合cyclinD-CDK复合物后抑制其活性, 调节G1进程.
2.1.1 P21WAF1: P21是许多肿瘤抑制因子如BRCA1、TGFβ等的下游效应子.Deeds et al[9]在SWISS 3T3成纤维细胞通过反义寡核苷酸技术同时抑制佛波酯依赖性PKCα和θ引起G1期阻滞, 其机制之一便是P21WAF1介导的Rb依赖性通路, 而非P53依赖性通路, 其中P21WAF1上调机制为转录调节和翻译后调节.PKB磷酸化P21WAF1 C-末端位点为Thr-145和Ser-146, Ser-146的磷酸化调节P21WAF1稳定性.P21WAF1在转录水平上受P53调节和激活, P21WAF1在P53介导的对DNA损伤所引起的停滞于G1期反应中起效应基因的作用; P21WAF1通过其氨基末端结合位点作用于CDK/cyclins复合体, 同时也能通过羧基末端结合核抗原增殖复合体, 从而抑制DNA多聚酶及DNA复制, 使损伤的DNA能在复制前修复, 故P21WAF1在阻止细胞进入S期中有双重作用.
2.1.2 P27: P27kipl能抑制包括cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2在内的多种G1期cyclin-CDK激酶活性, 使细胞不能通过G1期, 从而防止细胞过度增生形成肿瘤.当有丝分裂原存在时, cyclin D/CDK4与P27形成三聚体复合物, 使P27不再抑制cyclin E/CDK2.有趣的是cyclin E/CDK2的一个底物便是P27, cyclin E/CDK2磷酸化P27的Thr-187残基, 导致P27通过SCFSkp2泛素连接酶途径被降解.P27从核内向胞质的重分布需要Ser-10的磷酸化[10].Tomoda et al[11]研究显示Jab1基因编码的P38过度表达使P27从核内转移至胞质内, 并通过加速P27降解以降低其浓度.Porter et al[12]报道了一种新的细胞周期调节蛋白Spy1(Speedy 1), 也能结合并抑制P27, 推动G1进程.
包括P15(INK4B)、P16(INK4A)、P18(INK4C)、P19(INK4D)四个家族成员, INK4蛋白含有多个锚蛋白模序, 可与CDK4/6特异性结合.
2.2.1 P16INK4A: P16INK4A通过与cyclinD竞争性结合以及抑制CAK对CDK4/6的Thr161的磷酸化来抑制CDK4/6的活性.P16结合CDK6催化裂口的ATP结合位点附近, 即cyclin结合位点对面.INK4抑制剂通过使激酶催化裂口变形和干扰ATP结合来抑制CDK4/6-cyclinD复合体[13].
2.2.2 P15: P15蛋白同P16在前50个氨基酸有44%的一致性, 随后的81个氨基酸甚至有97%的一致性.P15含有4个锚蛋白序列, 能与CDK4、CDK6特异性结合, 阻止cyclin-CDKs复合物形成, 使视网膜母细胞瘤易感基因Rb的产物pRb蛋白不能磷酸化, 因而不能释放与之结合的转录因子E2F, 使细胞周期阻滞于G1期.用TGF-β处理人角质细胞后, P15诱导表达上升约30倍[14].
Rb和P53是涉及G1/S关卡控制的主要抑癌基因.另外, 在D-cyclins-CDK4/6-P16-pRb通路中也有已确定的抑癌基因如P16、E2F基因、hSNF5/ INI1基因和仍未确定的抑癌基因.
Rb基因为CDK/cyclins的下游效应子.大量调节细胞周期的抗增殖信号最后都集中在pRb以及相关的P107、P130.pRb有两种存在形式: 高磷酸化和低磷酸化.在G0期, pRb是非磷酸化的, G1期早、中期pRb被cyclinD低度磷酸化, 晚G1期, cyclinE与cyclinD使pRb高度磷酸化, 从而使之释放E2F转录因子, E2F与 DP1结合形成转录活性异二聚体E2F-DP1, 使启动与完成DNA复制相关蛋白表达: (1)生长所需蛋白cyclinE、cyclinA.(2)DNA复制所需蛋白: 如DNA聚合酶α, 胸苷激酶, 二氢叶酸还原酶, 组蛋白H2A等[6].CDK4/6磷酸化RB的C-末端启动C-末端与中心口袋区的分子内相互作用, 使HDAC从口袋区移位.A/B口袋是最先在pRb中确定的结合位点, 包括A区、B区和中间的插入序列.A/B口袋可以结合含有LXCXE模序的病毒癌蛋白和其他蛋白, P107和P130的A/B口袋相对保守, P107和P130偏向于结合E2F-4和E2F-5, pRb可以结合除了E2F-6以外的E2Fs[15].
P53是细胞进入S期的控制者, 在细胞周期的调控上起检查点的作用.正常情况下, P53结合负性调节蛋白Mdm2, 当细胞暴露于异常生长信号时, P53被激活, 触发下游基因的表达, P53转录激活的一个关键靶蛋白是P21, P21抑制cyclin E/A相关CDK2活性, 导致细胞周期阻滞.上游基因ATM和CH2调节p53表达, Mdm2 P19Arf负性调节P53, 但是P53的正常调节不由P19Arf介导, P19Arf调控通路在肿瘤形成的早期事件中激活, 其他如P53片段、突变型P53S、P63、P73也能调节P53表达[16].CHK2是保持细胞G1/S关卡完整性的关键信号, 他通过快速放大从DNA损伤到关卡效应因子的信号传导, 来延迟G1/S期进程和激活DNA修复.G1/S关卡调控机制通过ATM/ATR-CHK2-CDC25A关卡通路作用于下游效应因子来诱导快速的G1/S细胞周期阻滞.作为对外界刺激的反应, 上游信号传导激酶ATM/ATR激活CHK2, CHK2活化后, 以关卡通路的下游效应物为靶点, 沿多个通路传导关卡信号, 最终引起细胞周期在G1/S期阻滞, 激活DNA修复, 在细胞损伤严重的情况下, 诱导细胞凋亡、坏死.
hSNF5/INI1基因编码SWI/SNF染色质重构复合体的一个成员, 最近被确定为MRT(sporadic and hereditary malignant rhabdoid tumor)的抑癌基因.Versteege et al[17]发现野生型 hSNF5/INI1(非缩短型)的异位表达抑制MRT细胞进入S期, hSNF5/INI1诱导的G1期阻滞依赖于pRb, 并与E2F作用靶点如cyclin A、E2F1、CDC6等下调有关.另外还发现hSNF5/INI1 C-末端有SNF5同源区, 但SNF5结构域不足以诱导MRT细胞的G1期阻滞, 又为G1期阻滞所必需.
CDC25是一个双重特异性磷酸酶, 能消除CDKs的ATP锚定模序上Thr-14和Tyr-15的抑制性磷酸化, 对细胞周期运转起正调控作用, 同细胞转化、肿瘤形成、关卡控制、凋亡等有关.CDC25家族有CDC25A、CDC25B、CDC25C三个成员.其中CDC25A对G1/S转换和进入S期是必需的.CDC25A激活cyclin A/E-CDK2, 导致E2F释放, 反过来又诱导CDC25A转录.Jaime et al[18]报道小鼠P21-/-静息和再生肝中CDC25A水平高于野生型, 而且P21-/-细胞的CDC25A提前从胞质向核内移位, 说明P21调节CDC25A的水平和细胞内定位, 而且CDC25A核内移位与cyclin E/CDK2活性明显相关.CDC25A特异性对CDK2的Tyr15残基去磷酸化, 该去磷酸化对CDK2 的G1晚期激活至关重要.在人细胞株, CDC25A异位表达引起cyclin E/A依赖性激酶的提前激活, 从而提早进入S期.ATR/CHK1调节子对CDC25A的多个丝氨酸残基中度磷酸化, 通过泛素依赖性、蛋白酶体介导以维持CDC25A于适当的浓度.基因毒性应激时, CHK1和CHK2活性增强, CHK2蛋白通过磷酸化CDC25A而使其降解.CDC25A的下调使cyclin E/A-CDK2复合物不能维持活化状态, DNA复制受抑, 导致细胞晚G1期的生长阻滞.CH1/CH2-CDC25A限制点延迟G1/S过渡独立于P53, 该作用早于ATM(ATR)/CHK2(CHK1)-p53/MDM2-P21通路[19].
RACK1是最新发现的RACK(receptors for activated C kinase)家族成员之一, 抑制癌基因Src酪氨酸激酶和NIH 3T3细胞生长.RACK1的过度表达在G检测点抑制Src的活性, 诱导G1期部分阻滞, RACK1通过Src来抑制Vav2、Rho GTPases、stat3和Myc, 结果cyclin D1与CDK4和CDK2被抑制, 以及P27和pRb被激活, 从而使E2F1失活, 延迟G1/S进程.相反, 用小干扰RNA(siRNA)下调RACK1激活Src介导的信号传导, 诱导Myc和cyclin D1的表达, 加速G1/S进程.RACK1抑制Src为非MAPK依赖性PDGF信号传导, 最近研究表明stat3通路可能涉及此机制[20].
许多重要的G1期调控因子(如P27、cyclinD1等)为泛素的作用靶点, 随后被26S蛋白酶体所降解.泛素降解途径需要E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶.E3泛素连接酶有两个大类型被认为调节细胞周期进程: APC/C和SCF复合物.其中SCF复合物在G1进程中起重要作用, SCF复合物包含不变组分SKP1、CUL1/CDC53、RBX1以及可变组分F盒蛋白, F盒蛋白通过其F盒模序结合SKP1, 负责识别底物.哺乳动物细胞中的F盒蛋白有数百种之多, 大量的F盒蛋白结合SKP1、CUL1/CDC53、RBX1以及E2蛋白, 从而为众多底物的特异性泛素化通路奠定基础[21].hCDC4(Fbw7/Ago)为最近确定的F盒蛋白, 除F盒模序外, 还含有7个WD重复序列, 负责cyclin E蛋白的降解, CDC4通过F盒模序结合SKP1, 由此决定SCF复合物的底物特异性[22].P53除了通过P21信号途径控制细胞周期, 还可能通过hCDC4b激活阻滞细胞于G1期.Mamillapalli et al[23]发现在调节P27kip1的PTEN/PI3-kinase通路中, PTEN通过泛素E3连接酶 SCF(SKP2)调节P27的泛素依赖性降解, G1/S转换需要cyclin E和P27kip1的蛋白溶解.
Ras/Raf/MAPK级联反应是一种重要的信号传导通路, 包括Ras-GTP的形成, 细胞膜Raf激酶活化并激活MAPK激酶(MAPKK), 继而通过Ser和Tyr残基双磷酸化激活MAPK(ERK1/2), 活化的MAPK移入核内使三聚体因子(ternary complex factor, TCF)磷酸化, 后者再激活某些含有AP-1的立即早期癌基因如c-fos和egr-1等, 进而结合至启动子区的AP-1结合位点, 诱导cyclin D1等的转录, 促进P27的降解.Chiariello et al[24]观察到有丝分裂原刺激NIH3T3细胞引起MAPK的持续激活, 直到细胞开始通过G1/S转换, 其中MAPK通过调节CAK活性, 从而使CDK2磷酸化与激活.cyclin D1的表达也受PI3K调节: 一方面, PI3K激活p70s6激酶, 后者使核糖体S6蛋白磷酸化, 进而调节cyclin D1的翻译; 另一方面, 依赖PI3K/Akt的信号磷酸化GSK3β, 抑制其活性, 而GSK3β使cyclin D1的Thr-286残基磷酸化, 触发cyclin D1移位至胞质, 随后被泛素化和蛋白酶体所降解, 故PI3K减少cyclin D1的降解.最近又发现了一条新的信号传导通路, PI3K/Akt/FOXO介导上皮细胞的G1阻滞.PI3K通过Akt介导的翻译后和转录事件使细胞存活, Akt磷酸化并抑制Bad, 阻止FOXO依赖性Bim的表达以及IKK介导的NF-κB转录因子的激活[25].另外人们发现FOXO3负性调节P27.AFX(FOXO4)和FKHR-L1(FOXO3a)还直接调控P130蛋白, 使之表达上调.
总之, 随着人们对G1/S检测点正常调控机制的深入研究, 必将对肿瘤发生机制的探索起到推动作用, 为更有效的抗肿瘤治疗提供新的策略.
编辑:王谨晖 审读:张海宁
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