基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-08-28; 13(16): 1959-1963
在线出版日期: 2005-08-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i16.1959
HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应
吴映雅, 杜标炎, 谭宇蕙, 赵鹏, 王慧峰
吴映雅, 谭宇蕙, 广州中医药大学生化教研室 广东省广州市 510405
杜标炎, 赵鹏, 王慧峰, 广州中医药大学病理教研室 广东省广州市 510405
吴映雅, 女, 1969-03-31生, 广东省南海人, 汉族, 1991年南京大学本科毕业, 1997年暨南大学硕士研究生毕业, 2003年广州中医药大学在职博士生, 讲师, 主要从事中西医结合分子肿瘤学研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30171201; 广州市科技计划项目, No. 2002J1-C7041.
通讯作者: 杜标炎, 510405, 广东省广州市机场路12号, 广州中医药大学病理教研室. tyuhui@tom.com
电话: 020-36585475
收稿日期: 2005-05-13
修回日期: 2005-06-01
接受日期: 2005-06-15
在线出版日期: 2005-08-28

目的: 构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒, 建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.

方法: 构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk, 用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67, 通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株, 将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22, 以G 418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk); 将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1∶4混合接种小鼠皮下, 联合应用GCV, 观察其抑瘤作用(n = 19).

结果: 经酶切鉴定和DNA序列测定, 证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中; 重组病毒DNA转染包装细胞PT67, 获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液; 感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk. H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前, 各组间肿瘤体积无显著性差异; GCV治疗后, 与对照组相比, GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制, 到第8, 10, 12, 14 d, 致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205, 635±382, 963±580, 1 509±1 105 mm3, 而GCV治疗组分别为231±155 (vs对照组, t = -2.25, P = 0.03), 413±252 (vs对照组, t = -2.14, P = 0.04), 592±420 (vs对照组, t = -2.38, P = 0.02), 939±847 mm3(vs对照组, t = -1.92, P = 0.06), GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%, 35.0%, 38.5%, 37.8%.

结论: 成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒, 已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统, 为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

关键词: 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因; 自杀基因系统; 肝癌
引文著录: 吴映雅, 杜标炎, 谭宇蕙, 赵鹏, 王慧峰. HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应. 世界华人消化杂志 2005; 13(16): 1959-1963
Inhibitory effect of HSV1-TK suicide gene system induced by retrovirus on murine transplanted hepatocarcinoma
Ying-Ya Wu, Biao-Yan Du, Yu-Hui Tan, Peng Zhao, Hui-Feng Wang
Ying-Ya Wu, Yu-Hui Tan, Department of Biochemistry, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Biao-Yan Du, Peng Zhao, Hui-Feng Wang, Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30171201, and the Fund from Guangzhou Science and Technology Project, No. 2002J1-C7041.
Correspondence to: Biao-Yan Du, Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 12 Jichang Road, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China. tyuhui@Tom.com
Received: May 13, 2005
Revised: June 1, 2005
Accepted: June 15, 2005
Published online: August 28, 2005

AIM: To establish the HSV1-tk/GCV tumor suicide system by constructing a recombinant retroviral vector, and to determine the inhibitory effect of this system on murine transplanted hepetocarcinoma in vivo.

METHODS: The HSV-tk cDNA was orientationally cloned into the retroviral vector plasmid (pLXSN) using DNA recombinant technique. The recombinant plasmid (pLXSN-tk) was mixed with PolyFect Transfection reagent and was transfected into the packaging cell line PT67. Then, a stable virus-producing packaging cell lines was obtained by G418 screening, and was transfected into murine hepatocarcinomatous H22 cells. An anti-G418 clone named H22/tk was obtained by G418 screening. H22/tk and H22 wild type cells were mixed in a proportion of 1∶4. Then the mixed cells were inoculated subcutaneously into Kunming mice. The tumor-bearing mice were randomly divided into model control group and GCV treated group, and the tumor inhibitory effect was observed by measuring tumor sizes.

RESULTS: HSV1-tk was inserted into recombinant plasmid pLXSN-tk successfully. The anti-G418 positive cell strain PT67/tk, which could excrete retrovirus recombinant, was obtained. The titer of the virus was 4×107cfu/L. After the infection of H22, the anti-G418 positive cell strain H22/tk was also obtained. The sensibility to GCV showed in H22/tk cells was much higher than that in H22. Nearly all the cells lysed and became granule-like after treated with GCV (1 000 mg/L) for 72 h. The tumor growth in the GCV treated group was significantly inhibited as compared with that in the control group. There was no significant difference in tumor size between the two groups before the mice were treated with GCV. But at the 8th, 10th, 12th, 14th day after treatment with GCV, the tumor sizes in the GCV treated group were obviously decreased as compared with those in the control group (231±155 mm3vs 356±205 mm3, t = -2.25, P = 0.03; 413±252 mm3vs 635±382 mm3, t = -2.14, P = 0.04; 592±420 mm3vs 963±580 mm3, t = -2.38, P = 0.02; 939±847 mm3vs 1 509±1 105 mm3, t = -1.92, P = 0.06),and the tumor inhibitory rates were 35.0%, 35.0%, 38.5% and 37.8%, respectively.

CONCLUSION: The recombinant retrovirus expressing HSV1-tk is obtained successfully, and the HSV1-tk/GCV suicide gene system shows marked inhibitory effect on murine transplanted hepatocarcinoma.

Key Words: HSV1-tk; Suicide gene system; Hepatoca-rcinoma
0 引言

肝癌除了手术、化疗等尚无很好的治疗方法, 而且除根治性切除有可能根治肝癌外, 多数患者在确诊以后的生存时间较短.自杀基因疗法是具有应用前景的肿瘤治疗新措施[1-5].限制该方法广泛应用的关键之一是体内转染率通常较低.因其具有旁观者效应的特点(即加入前体药物后, 不仅导入了自杀基因的细胞被杀死, 邻近未导入的细胞也可被杀死), 故寻求与其他疗法联合以增强旁观者效应已成为提高自杀基因疗效的重要策略.我们重组逆转录病毒表达载体pLXSN/tk, 并观察其体内对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑瘤作用, 为探讨中医药增强自杀基因疗法疗效的可行性进行前期准备工作.

1 材料和方法
1.1 材料

1.7 kb的tk cDNA片段的质粒pICl9R/MCl-tk由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠, 广州军区总医院赵亚刚博士提供; pLXSN逆转录病毒表达载体、病毒包装细胞PT67均购自美国Clontech公司; 小鼠H22肝癌细胞株和小鼠NIH3T3细胞均购自于中山大学实验动物中心细胞库; E.coli DH5α菌株由本室保存.昆明小鼠, 18-22 g, 雌性, 健康, 清洁级, 由广州中医药大学实验动物中心提供; 高纯度质粒提取试剂盒和DNA片段凝胶回收试剂盒, 购自上海Sangon生物工程技术有限服务公司; DNA片段连接试剂盒, 购自广州宝泰克生物科技有限公司; 转染试剂盒Polyfect Transfection 为Qiagen公司产品; 多聚阳离子(polybrene)、G418、GCV均为Sigma公司产品; DMEM、胎牛血清和RPMI 1640均为Gibco公司产品; 新生牛血清为杭州四季青公司产品.

1.2 方法

pICl9R/MCI-tk质粒和逆转录病毒表达载体pLXSN质粒均转化DH5α后扩增、抽提纯化, 均用限制性内切酶EcoR I/BamH I酶切, 凝胶电泳证实pICl9R/MCI-tk质粒有l.7 kb HSV-tk cDNA目的片段, 回收、纯化此片段及pLXSN载体双酶切后的大片段, 在适当的反应体系中加入DNA片段连接试剂盒所提供的连接酶体系, 连接后转化感受态E.coli DH5α细菌, 挑选阳性克隆, 提取重组质粒, 酶切鉴定, 并命名为的pLXSN-tk.DNA序列测定由上海Sangon生物技术服务有限公司提供自动测序.细胞培养方式: 包装细胞PT67、NIH3T3为贴壁细胞, 分别培养于100 mL/L新生牛血清的DMEM高糖培养液和RPMI 1640培养液中, 置于37℃, 50 mL/L CO2的培养箱内, 2.5 g/L胰酶-EDTA消化传代.小鼠肝癌细胞H22为悬浮细胞, RPMI 1640培养液培养, 无需胰酶-EDTA消化即可传代.PT67的转染及阳性克隆细胞的筛选: 将2.5 μg的重组质粒DNA转染到PT67细胞中(具体操作按转染试剂盒说明书进行), 2 d后用G418(400 mg/L)筛选2 wk, 获得抗性细胞集落后, 提高G418的浓度分别继续扩大培养, 选择最高抗性克隆留种, 命名为PT67/tk细胞.取其细胞上清液, 参照试剂盒说明书操作, 用NIH3T3感染法进行病毒滴度测定, 病毒滴度以cfu/L(colony forming units/L)来表示.收集PT67/tk细胞上清液, 以0.45 μm的过滤器过滤, 加到对数生长期H22细胞中, 加多聚阳离子至终浓度为8 mg/L, 2 d后更换含400 mg/L G418的选择培养液, 连续筛选2 wk后, 获得抗性细胞克隆, 命名为H22/tk.将H22/tk和H22细胞分别以2×103、3×103、5×103/孔接种96孔板, 同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1 000 mg/L, 以不加药的细胞作对照, 每实验组设4个复孔, 倒置显微镜观察.将H22/tk和H22(tk-)按1∶4混合, 混合后的小鼠肝癌细胞制备成1×1010/L的细胞悬液, 台盼蓝活细胞计数>90%, 按0.2 mL/只的量接种于昆明种小鼠的右腋皮下.实验动物随机分为致瘤模型组和治疗实验组, 每组19只, 动物致瘤模型对照组在接种后6 d起每日ip生理盐水0.25 mL, 连续10 d; 治疗实验组接种后第6 d起每日ip GCV 0.25 mL(100 mg/kg), 连续10 d.观察小鼠活动情况, 毛发、营养等情况; 在治疗期间, 在肿瘤出现后每2 d用游标卡尺测定肿块的长径A(mm)及与短径B(mm), 肿瘤大小按公式: 体积(V) = 1/2×A×B2计算, 单位为mm3.根据测量的肿瘤体积大小绘制肿瘤生长体积曲线图.在治疗实验结束后处死小鼠, 取出肿瘤组织, 称重, 用40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片, HE染色, 光镜观察其病理组织学变化.

统计学处理 各组数据用采用SPSS11.5统计软件包, 数据先进行对数转换后进行t-test.

2 结果
2.1 重组质粒的构建、鉴定和转染

逆转录病毒载体pLXSN质粒经EcoR I, BamH I单酶切后为5.9 kb的DNA带, 新构建的pLXSN-tk质粒经EcoRI/BamHI双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳显示为1.7 kb和5.9 kb左右的2条DNA带(图1).重组pLXSN-tk质粒结构见图2.测序结果经分析比较, 碱基序列与文献[6]报道基本一致, 证明HSV-tk基因已被定向克隆入pLXSN载体中.所构建的表达载体中, 于插入基因的上游设有启动子序列、增强子序列、病毒包装信号序列ψ+, 下游有选择标记基因Neor, 经转染进包装细胞可被包装成具有感染性的逆转录病毒颗粒, 在感染动物细胞后可表达目的基因.包装细胞PT67经转染后选择G418抗性最高达1 g/L的阳性克隆(命名为PT67/tk)扩大培养, 收集上清液, 测定滴度为4×107cfu/L.取PT67/tk细胞上清液, 感染对数生长期H22细胞, 2 d后更换含400 mg/L G418的选择培养液, 连续筛选2 wk后, 获得抗性细胞克隆, 命名为H22/tk.

图1
图1 pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱. 1: pLXSN质粒/EcoRⅠ; 2: marker(l DNA HindⅢ); 3: pLXSN-tk质粒/EcoRⅠ; 4: pLXSN-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ; 5: marker(l DNA/EcoRⅠ+ HindⅢ).
图2
图2 pLXSN-tk质粒结构图.
2.2 GCV的敏感性和治疗作用

细胞铺板后倒置显微下观察, 细胞均匀透亮, 胞膜完整, 胞体呈圆形, 悬浮于培养液中; GCV作用72 h后, H22/tk细胞的1 000 mg/L浓度用药组中H22/tk全部细胞碎裂成小粒状, 孔内基本无活细胞生存, 100 mg/L浓度用药组中只能观察到极个别的存活细胞, 而其他各组包括H22(tk-)细胞的各浓度GCV作用组则呈现正常的明显的细胞增殖, 说明H22/tk对GCV的敏感性大大高于H22(tk-)细胞, HSV-tk基因已在肝癌细胞中表达.致瘤模型组和GCV治疗组在接种后6 d左右均能触及皮下肿瘤, 接种成功率100%, 随着肿瘤的增大, 小鼠逐渐表现为形体明显消瘦, 体重下降, 活动弛缓, 被毛无光泽.但GCV治疗组在治疗后小鼠状态明显好于致瘤模型组.治疗前各组间肿瘤体积无显著性差异.随着治疗进行, 治疗组体积与致瘤模型对照组间的差别逐渐增大, 肿瘤呈现生长抑制状态, 到第8, 10, 12, 14 d, 致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205 mm3, 635±382 mm3, 963±580 mm3, 1 509±1 105 mm3, 而GCV治疗组分别为231±155 mm3(vs对照组, t = -2.25, P = 0.03<0.05), 413±2252 mm3(vs对照组, t = -2.14, P = 0.04<0.05), 592±420 mm3(vs对照组, t = -2.38, P = 0.02<0.05), 939±847 mm3(vs对照组, t = -1.92, P = 0.06), GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%, 35.0%, 38.5%, 37.8%(图3).到第16 d剥取瘤块称重结果为: 致瘤模型对照组肿瘤质量为1.58±1.24 g, GCV治疗组为0.99±0.98 g, 抑瘤率为37.4%(vs对照组, t = 1.74, P = 0.09>0.05).病理观察显示致瘤模型组的肿瘤组织内肿瘤细胞数量较多, 密集, 大小不一, 核大而深染, 形状不规则, 肿瘤组织内肿瘤细胞坏死, 呈核固缩表现, 并见大片红染无结构的坏死组织, 肿瘤周边纤维组织增生不明显, 未见明显包膜.肿瘤边缘见少量炎细胞浸润; GCV治疗组的肿瘤组织内肿瘤细胞数量密度相对较少, 肿瘤组织内肿瘤细胞坏死, 呈核固缩表现, 并见大片红染无结构的坏死组织, 肿瘤周边纤维组织增生较明显, 形成较明显的假包膜, 肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润.

图3
图3 小鼠肿瘤生长曲线.
3 讨论

我国是肝癌的高发国家, 目前对肝癌的治疗最常用的方法是"以手术为主综合治疗"的原则.但肝癌对化疗和放疗均不敏感, 能手术根治的肝癌仅占15%.肝癌的基因治疗, 在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发、转移以及提高患者生活质量方面可能具有独特的优势.近年来肝癌基因治疗成为肝癌治疗活跃的研究领域.肿瘤的基因治疗, 特别是自杀基因治疗, 已经成为继传统的手术切除, 放射治疗, 化学药物治疗等治疗方法之后一种新的抗肿瘤治疗措施[7-12].HSV-TK/GCV治疗系统为其中最常用、最重要的治疗系统之一.

基因治疗的临床应用由于存在体内基因转染效率低等问题而受到限制, 目前的研究热点多集中在如何提高旁观者效应[8,13-29].根据其产生的机制人们认为提高旁观者效应可通过下列途径: (1)增加细胞间的"缝隙连接", 使GCV的代谢产物从tk+细胞进入tk-细胞增多; (2)延长凋亡细胞存在时间, 增强机体抗肿瘤免疫反应; (3)改善自杀基因抗肿瘤作用的整体免疫状态和局部炎症免疫微环境.中药是一个天然药物宝库, 在促进肿瘤细胞的缝隙连接胞间通讯、诱导癌细胞凋亡或提高患瘤机体免疫力这三方面都有优势或潜力, 且具有价廉低毒、给药方便等优势.因而设想中药方药能够通过上述机制提高自杀基因旁观者效应, 增强自杀基因的抗肿瘤作用.我们准备对上述设想进行一系列的验证工作, 以期建立自杀基因联合中医药疗法的中西结合肿瘤基因治疗的联合治疗方案[30].

我们将HSV-tk基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN中, 并进行病毒包装, 筛选出稳定生产带有该重组逆转录病毒的细胞株PT67/tk.将逆转录病毒感染肿瘤细胞, 检测HSV-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应, 经GCV对小鼠肝癌细胞H22的体外杀伤试验, 结果表明HSV-tk基因已在肝癌细胞中表达; 体内抑瘤实验显示, 在肿瘤细胞移植后的8, 10, 12 d, HSV-tk/GCV系统对移植瘤的生长有明显的抑制作用, H22/tk混合接种肿瘤细胞用GCV治疗后显示35.0-38.5%的抑瘤率.但在肿瘤细胞移植后14 d(即在GCV治疗第8 d)治疗组虽还显示抑瘤趋势, 但差异无统计学意义, 第16 d剥取瘤块的质量比较也显示类似结果, 可能是由于H22/tk细胞已经有大部分被杀死而剩余的野生型tk-细胞已经开始占主要地位继续生长所致.本实验在筛选时由于条件限制没有进行严格的单克隆分选, H22/tk细胞群中可能混有少量的野生型细胞, 但在这样的细胞混合比例下仍显示出明显的抑瘤效果, 说明采用20%H22/tk混合接种肿瘤细胞的方案可为自杀基因与中医药联合疗法的研究提供较为适当的动物实验模型, 因为这可留下空间让我们观察中医药的作用.

本研究构建HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统并进行体内抑瘤实验为今后的研究工作打下了基础.

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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