阿霉素对胃癌细胞内游离Ca2+浓度的影响

摘要

目的: 探讨阿霉素诱导胃癌细胞凋亡过程中细胞内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)的变化特点及意义.

方法: 选择阿霉素诱导胃癌细胞凋亡, 采用光镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡; Fura-2荧光负荷技术测定[Ca²⁺]i.

结果: 4 mg/mL阿霉素作用于胃癌细胞24 h出现典型的凋亡改变, 即光镜和电镜见凋亡小体、细胞皱缩、染色质固缩和片段化, 琼脂糖电泳观察可见DNA梯状条带, 流式细胞仪上见"凋亡峰"; 阿霉素诱导胃癌细胞凋亡过程中[Ca²⁺]i于1/120(30 s), 2, 6, 12和24 h依次为191, 177, 151, 170和146 nmol/L, 均明显高于对照组127 nmol/L(P<0.01或P<0.05), [Ca²⁺]i的升高以凋亡早期更为明显.

结论: 阿霉素可以通过诱导胃癌细胞凋亡发挥抗癌作用, 其诱导胃癌细胞凋亡过程中细胞内游离Ca²⁺浓度表现为上调趋势.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2005
Revised: June 6, 2005
Accepted: June 13, 2005
Published online: July 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病, 同时也是凋亡异常的疾病, 在我国胃癌发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤之首位, 是威胁人类健康的最重要疾病之一, 而胃癌的发生、发展和浸润转移也与凋亡密切相关[1-3]. 阿霉素是胃癌化疗的常用药物[4-5], 其抗癌过程的信号调控机制尚不十分清楚, Ca²⁺是各种生命现象信号传导中的重要信号分子[6-7], 但在阿霉素诱导的胃癌细胞凋亡中的意义, 尚未见报道. 关于阿霉素的抗癌作用, 大多认为通过抑制胃癌细胞增殖而发挥其作用, 本研究采用阿霉素诱导人胃癌细胞系BGC823凋亡, 检测胃癌细胞凋亡各阶段细胞内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)的变化, 探讨阿霉素诱导胃癌细胞凋亡的作用以及该过程中细胞内游离Ca²⁺浓度的变化特点及意义.

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640为美国LIFE TECH公司产品; 胰蛋白酶(Trypsin)为美国Difco公司产品; 钙荧光指示剂Fura-2/AM为美国Sigma公司产品; 人胃癌细胞系BGC823由北京肿瘤研究所惠赠.

1.2 方法

1.2.1 胃癌细胞培养和诱导凋亡检测: 人胃癌细胞系BGC823复苏后培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640营养液中, 置于CO₂培养箱(37 ℃, 50 mL/L的CO₂, 950 mL/L的相对湿度), 2-3 d传代一次. 取对数生长期细胞, 加阿霉素至终浓度为4 mg/L, 选择不同时间点用光镜、常规透射电镜和扫描电镜制片, 观察胃癌细胞凋亡的形态学变化. 收集各时间点细胞(10⁶个), 提取DNA, 用含溴化乙锭的15 g/L琼脂糖电泳观察DNA条带, 照相; 收集阿霉素处理的各个时间点细胞(10⁶个), 制成细胞悬液, 用流式细胞仪进行细胞周期分析, 激光激发波长为488 nm.

1.2.2 细胞内游离Ca²⁺浓度测定: 胃癌细胞系BGC823加阿霉素后不同时间收集细胞, 消化后, 用100 mL/L的RPMI 1640洗涤2次, 细胞悬液37 ℃预温5 min, 加入终浓度5 mmol/L Fura-2/AM, 37 ℃, 恒温振荡45 min, 持续通950 mL/L O₂, 50 mL/L CO₂混合气, 以一定量HPSS终止反应, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清, 再次洗涤1次(同上), 最后细胞悬液于HPSS中调整细胞数为2×10⁹/L, 每次测细胞内游离Ca²⁺浓度前再以HPSS离心洗涤1次(同上), 然后37 ℃复温5 min, 以分光光度计检测, 发射光波长为510 nm, 激发光波长为340及380 nm, 两波长下最大荧光由加入终浓度为2 g/L Triton测得, 最小荧光由加入终浓度为8 mmol/L(pH>8.5)的EGTA获得, 每次测细胞内游离Ca²⁺浓度前输入在上述两激发波下测得的细胞悬液自发荧光值及解离常数(224 nmol/L), 输入电脑软件运算可得出细胞内游离Ca²⁺浓度.

统计学处理 用t检验, P<0.05为有统计学意义.

2 结果

2.1 阿霉素诱导胃癌细胞系BGC823凋亡及其检测

4 mg/mL阿霉素到终浓度为诱导凋亡, 加药后24 h出现典型的凋亡改变, 即相差显微镜: 用阿霉素处理24 h后见细胞核浓缩, 细胞变圆, 可见膜突起和起泡, 细胞完整, 见凋亡小体; 透射电镜: 收集阿霉素处理24 h细胞, 电镜观察见典型凋亡所见, 核染色质积聚边集, 新月形或帽状, 细胞器结构清晰, 胞质浓缩或裂解成质膜包绕的碎片; 扫描电镜: 细胞变圆, 可见胞膜突起和起泡, 胞核浓缩; 琼脂糖凝胶电泳: 顺铂处理24 h, 在电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带, 对照组无此特征; 流式细胞仪; 阿霉素处理24 h, 见G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型.

2.2 细胞内游离Ca²⁺浓度测定结果

未加阿霉素处理的对照组细胞内游离钙离子浓度波动于124-130 nmol/L, 平均浓度为127±3 nmol/L. 加阿霉素至终浓度4 mg/L, 诱导凋亡, 检测处理1/120(30 s), 2, 6, 12和24 h后细胞内游离钙离子浓度, 结果表明, 细胞凋亡各阶段细胞内游离钙离子浓度明显升高(P<0.05), 而以处理30 s时最高(表1).

表1 阿霉素诱导胃癌细胞凋亡过程中[Ca²⁺]i变化(mean±SD).

加药时间	[Ca2+]i(nmol/L)	P
30 s	191±12	<0.01
2 h	177±15	<0.01
6 h	151±9	<0.01
12 h	170±13	<0.01
24 h	146±10	<0.05
对照组	127±3

3 讨论

我国胃癌发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤之首位. 胃癌发生机制的研究表明其是多阶段、多步骤和多因素共同作用的结果, 包括细胞增殖过度、分化异常和凋亡减少[8-10], 近年来对凋亡在胃癌发生过程中的作用日趋受到重视, 而凋亡的信号调控机制尚不十分清楚. 细胞内信号传导过程主要包括三个信使系统[11-13]: 腺苷酸环化酶系统, 肌醇脂质系统和钙-钙调蛋白系统, 三个信使系统中的主要信号分子包括环磷酸腺苷、三磷酸肌醇、蛋白激酶 C和Ca²⁺等. 从分子水平探讨肿瘤细胞发生机制的研究日趋受到学者们的重视, 对其信号传导机制的研究倍受关注, 近年对钙信号传导的研究涉及包括肿瘤发生在内的很多生命现象[14-15]. 研究[16]表明细胞内游离钙离子浓度的变化来源于细胞外Ca²⁺通过细胞膜Ca²⁺通道的跨膜转运和细胞内Ca²⁺池释放共同作用的结果, 细胞膜Ca²⁺通道分为受体操纵性钙通道和电压依赖性钙通道, 钙通道开放可使细胞外钙进入, 导致细胞内游离钙离子浓度升高, 同时可以启动Ryanodine受体(RyR)系统而触发Ca²⁺诱导的Ca²⁺释放(CICR机制). 细胞内贮钙主要通过三磷酸肌醇受体(IP₃R)系统和RyR系统来动员, IP₃R和RyR分布于各种细胞的肌浆网(ER)膜上, 当细胞外信息通过G蛋白介导激活磷脂酶C, 水解磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸生成第二信使IP3和二酰基甘油(DG), IP₃激活ER上的IP₃R, 使Ca²⁺释放增加(IICR机制), 细胞内游离钙离子浓度升高[17]; 加之CICR机制, 二者协同作用使细胞内游离钙离子浓度升高. 研究[18-19]发现细胞内Ca²⁺信号是细胞多条信号传导途径的枢纽, 对钙信号的研究逐渐受到重视. 正常状态下Ca²⁺主要存在于细胞外, 细胞内游离Ca²⁺含量很低, 然而正是这些含量甚微的Ca²⁺却发挥着重要作用[20-21]. 因此, 本研究首先选择细胞内游离Ca²⁺作为研究阿霉素诱导的胃癌细胞凋亡的信号传导机制的突破点, 应用Fura-2为结合Ca²⁺的荧光指示剂测定阿霉素诱导的胃癌细胞凋亡各阶段细胞内游离钙离子浓度, 观察其动态变化.

本研究首先用阿霉素诱导胃癌细胞凋亡, 以建立凋亡模型, 为下一步实验奠定基础, 结果表明, 加阿霉素到终浓度为4 mg/L诱导凋亡, 加药后24 h出现典型的凋亡改变. 关于阿霉素的抗癌作用, 大多数学者[22-24]认为通过抑制胃癌细胞增殖而发挥其作用, 而本研究结果显示阿霉素诱导胃癌细胞凋亡也是其抗肿瘤作用的重要机制, 说明阿霉素可以通过诱导胃癌细胞凋亡发挥抗癌作用.

为进一步研究阿霉素诱导胃癌细胞凋亡的分子机制, 特别是信号传导机制, 本研究选择细胞内游离Ca²⁺作为研究其信号传导机制的突破点, 细胞内游离钙离子浓度的变化来源于细胞外Ca²⁺通过细胞膜Ca²⁺通道的跨膜转运和细胞内Ca²⁺池释放共同作用的结果[25-26], 本研究发现对照组细胞内游离Ca²⁺浓度为127 nmol/L, 加阿霉素诱导凋亡的过程中, 细胞内游离Ca²⁺浓度波动于191-146 nmol/L, 明显高于对照组, 提示Ca²⁺信号参与此凋亡过程, 并作为一个重要的信号分子发挥作用. 既往用其他药物诱导肿瘤细胞凋亡时, 也发现细胞内游离Ca²⁺浓度升高可激活Ca²⁺依赖核酸内切酶引起DNA片段化和细胞凋亡[27-28]. 本研究证明阿霉素诱导胃癌细胞凋亡时细胞内游离Ca²⁺浓度也升高, 与其他肿瘤细胞凋亡时细胞内游离Ca²⁺浓度变化一致, 说明Ca²⁺在阿霉素诱导胃癌细胞凋亡过程中也起重要作用.

本研究发现阿霉素诱导胃癌细胞凋亡是其抗癌作用重要机制, 钙离子信号可作为一个重要的信号分子, 参与阿霉素诱导胃癌细胞凋亡过程, 同时, 也为抗信号传导诱导胃癌细胞凋亡的研究奠定基础.

备注

编辑:王谨晖 审读:张海宁

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