乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定

摘要

目的: 提取和鉴定参与乳杆菌黏附肠上皮样细胞以及粘蛋白受体的细胞壁表面蛋白.

方法: 采用HRP标记的粘蛋白受体以及NHS-Biotin标记的HT-29细胞与提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白进行蛋白印迹, 对参与黏附的细胞壁表面蛋白进行初步鉴定.

结果: Western blot 结果显示M_r 29 000和M_r 14 000的两种细胞壁表面蛋白在与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性.

结论: 存在于乳杆菌JCM1081细胞壁表面的M_r 29 000和M_r 14 000的两种蛋白能够特异性识别粘蛋白受体和细胞膜受体, 并与之结合, 为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2005
Revised: June 5, 2005
Accepted: June 8, 2005
Published online: July 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乳杆菌是人体肠道内正常的生理性有益菌, 是肠黏膜生物屏障的主要组成部分, 进入肠道内的乳杆菌通过黏附、定植于肠黏膜表面以保护肠黏膜上皮细胞免受各种病原微生物的损伤, 所以乳杆菌在肠道内的黏附、定植是其发挥生理作用的前提和基础. 黏附是细菌与宿主细胞相互作用的第一步, 黏附过程首先是细菌的黏附素与宿主细胞表面的特异性黏附素受体识别, 并与之结合, 其后才引起一系列细胞变化过程. 早在1985年, Op den Camp et al[1]在研究双歧杆菌黏附时发现, 其细胞壁脂磷壁酸(LTA)与其黏附有关, 提示LTA参与了乳杆菌对肠上皮细胞的黏附. LTA可能先锚定于细菌表面蛋白分子上, 然后通过其脂类部分与宿主细胞表面的纤维连结蛋白结合[2]. 随后, 一些学者又先后发现乳杆菌的胞壁表面蛋白以及胞外分泌型蛋白等也与黏附有关[3-4], 而且在有些乳杆菌的外表面, 还发现存在有一层呈单分子晶体排列的S层蛋白, 也参与了乳杆菌的黏附[5-6]. 但到目前为止, 对其黏附的具体机制以及黏附素蛋白仍缺乏较为深入的研究. 为此本实验通过提取乳杆菌细胞壁表面蛋白, 对其参与黏附的表面蛋白进行了初步研究.

1 材料和方法

1.1 材料

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)JCM1081, 购自日本理化研究所微生物保藏中心. 人结肠癌细胞株HT-29, ATCC编号HTB-38, 由西南医院中心实验室惠赠. 胰蛋白酶购自华美生物科技公司, 新生牛血清购自天津TBD公司, DMEM培养基购自Gibco公司, 粘蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、弗氏完全佐剂和不完全佐剂均购自Sigma公司, Sulfo-NHS-Biotin购自PIERCE公司, HRP-羊抗兔IgG和DAB显色试剂盒均购自博士德生物公司.

1.2 方法

1.2.1 细菌培养: 罗伊氏乳杆菌JCM1081在含100 mL/L甘油的MRS中-80 ℃保存, 将以上菌株接种于新鲜配制的MRS液体培养基, 37 ℃培养24 h.

1.2.2 细胞培养: 将HT-29细胞置于含100 mL/L热灭活的新生牛血清和双抗(青霉素、链霉素浓度各为10 万U/L)的DMEM细胞培养液中, 37 ℃、100 mL/L CO₂的二氧化碳培养箱中孵育, 每天换液一次, 每周传代一次, 15-20 d后进行实验.

1.2.3 乳杆菌细胞壁表面蛋白的提取: 采用Aleljung和Maurilia的方法[7-8]. 方法1: 将-80 ℃低温保存的乳杆菌JCM1081菌种按10 mL/L的比例接种于新鲜配制的MRS培养基中, 37 ℃培养24 h, 培养至稳定期, 收集菌体离心(6 000 g)15 min, 并用冷的PBS缓冲液洗涤细菌2次, 最后用20 mL PBS重悬菌体. 在重悬液中加入溶菌酶(2 g/L), 37 ℃温育1 h. 将上述重悬液离心(12 000g)15 min, 沉淀菌体用1 mol/L氯化锂重悬, 20 ℃温育20 h. 离心收集上清(8 000 g, 30 min), 上清液在0.01 mol/L PBS中4 ℃透析过夜, 收集样品, 冻干后备用. 方法2: 将-80 ℃低温保存的乳杆菌JCM1081菌种按10 mL/L的比例接种于新鲜配制的MRS培养基中, 37 ℃培养24 h, 培养至稳定期, 收集菌体离心(6 000 g)15 min, 并用冷的PBS缓冲液洗涤细菌2次. 然后加入含30 mmol/L碳酸铵、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、5 mmol/L EDTA以及10 g/L蔗糖(pH 8.0)溶液重悬菌体, 后加入含2 000 U的变溶菌素、20 mg(10 900 kat/mg)溶菌酶的混合裂解液, 37 ℃共孵育30-60 min, 通过测定其A590, 以检测其原生质体的形成率. 将上述菌液以10 000 g离心10 min, 4 ℃, 上清液在50 mmol/L碳酸氢铵溶液中(pH 7.0)透析过夜, 收集样品贮于-20 ℃.

1.2.4 粘蛋白的标记: 取粘蛋白溶解于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液中(pH9.5), 配制成4 g/L的粘蛋白溶液; 将HRP 8 mg溶解于2 mL蒸馏水中, 配制成HRP溶液, 然后加入至400 mL新鲜配制的0.1 mol/L过碘酸钠溶液中, 混合物室温下搅拌20 min, 然后置于0.001 mol/L(pH4.4)乙酸盐缓冲液中, 4 ℃透析过夜; 取出透析后的HRP, 加入0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)20 mL调节pH至9.0-9.5; 取1 mL粘蛋白和1 mL HRP溶液混合, 置于室温下混合搅拌2 h, 然后加入新鲜配制的4 g/L的硼氢化钠溶液100 mL以除去连接反应; 混合液置于0.1 mol/L(pH7.4)的硼酸缓冲液中, 4 ℃透析过夜, 标记好的粘蛋白等体积加入800 mL/L甘油, -20 ℃保存.

1.2.5 细胞的标记: 培养至单层的HT-29细胞用胰蛋白酶消化后, 用PBS(pH8.0)洗涤3次, 4 ℃, 以除去培养基中所含有的其他蛋白. 然后用PBS(pH8.0)重悬细胞, 调整细胞浓度至2×10⁹/L. 加入标记物Sulfo-NHS-Biotin(1.0 g/L), 使其在细胞中的浓度为2 mmol/L(每毫升细胞悬液中加入200 mL 10 mmol/L Biotin). 将细胞置于室温下共孵育30 min, 然后用PBS+100 mmol/L甘氨酸洗涤细胞3次, 以抑制和除去未标记的Biotin.

1.2.6 乳杆菌多克隆抗体的制备: 将乳杆菌JCM1081菌液用灭菌的PBS洗涤2次后, 用PBS重悬(浓度为1-2×10¹¹ CFU/L)与弗氏完全佐剂等体积混合, 乳化完全后, 选用新西兰兔4只, 每组2只, 背部皮下和皮内多点注射, 每点注射量0.2 mL左右. 第1次免疫后, 10-12 d后进行第2次注射, 第2次注射采用不完全佐剂, 开始出现IgG抗体; 第2次注射后4 d, 进行第3次注射, 第2次与第3次注射方式和剂量同第1次. 第3次注射后3 d, 耳缘静脉采血ELISA检测抗体效价, 如果效价较低可继续进行免疫, 直到出现合适效价的抗体.

1.2.7 罗伊氏乳杆菌: JCM1081细胞壁表面蛋白的SDS-PAGE和Western Blot 提取的罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE, 采用120 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶的不连续浓度梯度, 100 V恒压120 min. 电泳完毕后, 一部分胶用考马斯亮蓝R-250进行染色, 另一部分胶移至电转膜仪上, 将蛋白电转移至PVDF膜上, 然后将HRP标记的粘蛋白和NHS-Biotin标记的细胞分别与PVDF膜上的蛋白置于37 ℃、100 mL/L CO₂培养箱中杂交孵育1 h, 洗涤后加入DAB显色试剂, 待显色后, 用TBS洗涤膜以终止显色, 出现棕色条带表明目的蛋白与黏附素受体结合.

将HT-29细胞接入T75 Flask中, 加入DMEM培养液6 mL, 置于37 ℃、100 mL/L CO₂培养箱中孵育, 待长至单层细胞后, 用灭菌的PBS(pH7.2)或0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.0, 含0.01 mol/L NaCl)洗涤2次. 加入12 mL浓度为100 mg/L 的JCM1081细胞壁表面蛋白液, 37 ℃温育1 h, 阴性对照中只加入相应的缓冲液. 然后用上述缓冲液洗涤细胞3次. 细胞用cell rubber pliceman刮取, 并用缓冲液重悬, 置于50 mL的Falcan tube中, 再用缓冲液洗涤1次, 并转入1.5 mL Eppendorf管中. 在装有细胞的Eppendorf离心管中加入1 mL 0.1 mol/L盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)重悬细胞, 进行洗脱, 1 500 r/m离心5 min. 上清液加入0.2 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液. 然后置于330 g/L的PBS缓冲液中, 4 ℃透析过夜. 收集样品, 进行SDS-PAGE, 不连续浓度, 50 g/L的浓缩胶和120 g/L分离胶, 上样后, 稳压100 V, 120 min后将蛋白转移至PVDF膜上. 用兔抗JCM1081的多克隆抗体进行杂交, 洗膜后, 再加入HRP-羊抗兔的IgG(1:200)进行共孵育, 最后用适当稀释的DAB显色液进行显色. 另一部分样品进行同样的处理, 即进行SDS-PAGE, 然后用考马斯亮蓝进行染色.

2 结果

2.1 乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白与粘蛋白受体结合的Western blot采用两种不同的方法

对罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白进行了提取, 将提取的细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE, 从SDS-PAGE图谱中可以看出, 利用方法1(溶菌酶结合氯化锂方法)提取得到的细胞壁表面蛋白与利用方法2(溶菌酶结合变溶菌素的方法)提取得到的细胞壁表面蛋白基本相似, 但在M_r 29 000和M_r14 000的范围内略有差异. 将上述两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE, 并将蛋白转移至PVDF膜上, 然后与HRP标记的粘蛋白受体进行杂交, 结果显示, 在M_r 29 000和M_r 14 000的蛋白处呈现强阳性, 并且在用方法1提取的蛋白中还有一个M_r 26 000的蛋白也呈现阳性, 而作为阴性对照的白蛋白无杂交阳性出现.

2.2 乳杆菌细胞壁表面与HT-29细胞黏附的黏附相关蛋白鉴定

将两种方法提取的细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE, 并将蛋白转移至PVDF膜上, 然后与NHS-biotin标记的HT-29细胞杂交, 结果表明, 利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白中出现了两条阳性条带, 分别为:M_r 29 000和M_r 14 000, 而作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)并未出现杂交条带, 表明M_r 29 000和M_r 14 000这两种细胞壁表面蛋白可以特异性识别HT-29细胞膜表面的黏附素受体, 并与之结合.

为了进一步证实乳杆菌与细胞黏附的胞壁表面蛋白, 将上述利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白与HT-29细胞进行共孵育后, 通过漂洗以除去未黏附的蛋白, 然后将细胞刮下来, 用0.1 mol/L盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱, 洗脱下来的蛋白透析后进行了SDS-PAGE, 并将蛋白转移至PVDF膜上, 与JCM1081的多克隆抗体杂交, 从Western blot图谱上可以看出, 洗脱下来的蛋白中杂交产生了一条阳性条带, M_r 29 000, 而加入相应缓冲液(无细胞壁表面蛋白)的阴性对照中未出现阳性条带.

3 讨论

黏液粘蛋白是广泛分布在胃肠道黏膜表面的一种糖蛋白, 由杯状细胞分泌产生, 存在于肠上皮细胞表面形成一层黏液胶层, 保护细胞免受肠道致病菌的损伤. 由于这种黏液层为肠道内的生理性有益菌和潜在的致病菌提供了生态位, 进入肠道内的微生物定植于此, 随着肠蠕动和黏液流动而被排除, 以阻止细菌进一步与上皮细胞接触. 因此, 黏液粘蛋白为进入肠道内的细菌黏附、定植提供了受体位点[9]. 有学者[10-12]曾通过提取和纯化肠黏液粘蛋白, 作为黏附素受体来检测益生菌与粘蛋白的黏附状况, Rojaset al[8,13]以提纯的小肠粘蛋白作为受体, 用HRP标记后与发酵乳杆菌104R的菌体表面蛋白进行Western blot, 成功鉴定了菌体表面蛋白中参与黏附的黏附素蛋白.

为了探讨乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白在黏附过程中的作用, 我们采用不同的方法提取了乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白, 进行SDS-PAGE后分别与HRP标记的粘蛋白受体和NHS-Biotin标记的HT-29进行杂交, Western blot 结果显示, 在乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白中, M_r 29 000和M_r 14 000的两种蛋白在与粘蛋白和细胞的杂交中都出现了强阳性, 表明这两种蛋白都能够特异性与粘蛋白受体和HT-29细胞结合, 提示这两种蛋白可能参与了乳杆菌JCM1081与粘蛋白以及细胞的黏附. 尤其对于与细胞的黏附, 由于细胞膜表面分布有细菌黏附素的特异性受体, 我们首次采用NHS-Biotin标记HT-29细胞, 与电泳分离的乳杆菌细胞壁表面蛋白进行杂交, 鉴定出与细胞膜受体特异性结合的乳杆菌细胞壁表面蛋白. Hayman et al[14]曾采用大鼠的肾细胞(NRK)与转移到纤维素膜上的血浆中的未知蛋白进行杂交, 成功鉴定出一种新的与细胞黏附有关的血清扩散因子(SSF), 表明利用这种方法能够灵敏的检测到与细胞黏附的特异性蛋白. 以上结果显示, M_r 29 000和M_r 14 000两种蛋白不仅可以和粘蛋白受体特异的结合, 而且还能够与细胞膜受体特异性结合, 表明这两种蛋白为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.

另外, 我们将提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白与细胞共孵育后, 利用不同的缓冲液对黏附至细胞表面与膜受体特异性结合的蛋白进行洗脱, 洗脱下来的蛋白进行免疫印迹, 通过乳杆菌JCM1081的多克隆抗体对与膜受体特异性结合的乳杆菌细胞壁表面蛋白进行鉴定, 结果显示, 在M_r 29 000处有条阳性条带, 表明这种M_r 29 000的蛋白为乳杆菌细胞壁表面蛋白, 能够与细胞膜上的受体特异性给合. 这与Granato et al[15]研究报道的结果不尽一致, Dominique研究发现分子量为M_r 50 000的EF-Tu是 Lactobacillus johnsonii NCC533的黏附素蛋白, 此黏附素蛋白参与了Lactobacillus johnsonii NCC533和HT-29细胞的黏附过程. 这可能是由于乳杆菌JCM1081和约氏乳杆菌NCC533属不同的种, 所以参与黏附的蛋白存在很大差异. 但是与前面采用HRP标记的粘蛋白和NHS-Biotin标记的细胞检测到的黏附素蛋白一致, 只是未出现M_r 14 000的杂交阳性条带, 这可能是因为采用的抗JCM1081的抗体为多克隆抗体, M_r 14 000的蛋白未出现杂交阳性可能是由于此小分子蛋白免疫原性较低, 或含量较少. 但前面的实验已证实乳杆菌细胞壁表面蛋白中M_r 29 000和M_r 14 000这两种蛋白是参与乳杆菌与粘蛋白黏附的外表面黏附相关蛋白, 而且可以和标记的HT-29细胞特异性结合, 所以结合以上实验结果, 提示M_r 29 000和M_r 14 000蛋白是乳杆菌JCM1081的黏附素蛋白, 其不仅参与了乳杆菌与粘蛋白的黏附, 同时也参与乳杆菌与肠上皮样细胞HT-29黏附.

Alelijung et al[7]在罗伊氏乳杆菌NCIB11951中发现了两个与Ⅰ型胶原黏附有关的细菌表面蛋白Cnb(Collagen binding protein, 胶原结合蛋白), Cnb蛋白M_r 29 000, 氨基酸序列分析表明含有两个典型的胞外受体连接区的基序. Cnb基因上游的一个开放阅读框(ORF)与ATP连接组分有高度同源性, 有别于S层蛋白家族. 另一个Cnb蛋白M_r 31 000, 与M_r 29 000的蛋白在抗原性方面有交叉反应, 说明是同一类型相关蛋白, 但其N-端氨基酸序列同源性较低, 推测这可能是由于M_r 31 000蛋白由于修饰或降解, 造成了N-端信号序列的缺失, 由此引起分子量以及N-端氨基酸序列的不同. Maurilia et al[8]研究发现, 在Lactobacillus fermentum 104R的细胞壁表面存在一种与其黏附有关的蛋白, 称之为粘蛋白黏附促进蛋白(MAPP), 这种蛋白M_r 29 000, 呈二聚体或多聚体, 以非共价键连接在细菌表面, 在细菌生长进入稳定期后, 这种蛋白便可释放到培养上清中, 此蛋白可介导Lactobacillus fermentum 104R与猪的小肠黏液以及猪胃粘蛋白的黏附, 其N-端氨基酸序列与Cnb蛋白有一定的相似性. 关于我们鉴定出的M_r 29 000蛋白是否与Cnb和MAPP为同一类蛋白, 还有待于蛋白测序后进行深入的比较研究.

备注

编辑:王谨晖 审读:张海宁

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