基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-07-28; 13(14): 1721-1724
在线出版日期: 2005-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i14.1721
103pd 诱导犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡及对相关基因的影响
何贵金, 吴荣, 高沁怡, 许书河, 高红, 姜维国, 蒋涛, 戴显伟, 马凯
何贵金, 戴显伟, 马凯, 中国医科大学第二临床学院普外科 辽宁省沈阳市 110004
吴荣, 中国医科大学第二临床学院放疗中心 辽宁省沈阳市 110004
高沁怡, 中国医科大学第一临床学院同位素室 辽宁省沈阳市 110001
许书河, 中国原子能研究院同位素研究室 北京市 100050
高红, 蒋涛, 中国医科大学第二临床学院儿外实验室 辽宁省沈阳市 110004
姜维国, 中国医科大学第二临床学院病理科 辽宁省沈阳市 110004
何贵金, 男, 1962-6-29生, 辽宁省沈阳市人, 汉族, 1988年中国医科大学本科毕业, 2003年博士研究生毕业, 普外科副教授, 主要从事肝胆疾病内放射治疗研究.
通讯作者: 何贵金, 110004, 辽宁省沈阳市和平区三好街36号, 中国医科大学第二临床学院普外科.
收稿日期: 2005-03-14
修回日期: 2005-03-26
接受日期: 2005-04-01
在线出版日期: 2005-07-28

目的: 探讨g射线对胱冬肽酶-3(caspase-3), Fas和bcl-2基因在犬胆管壁增殖平滑肌细胞凋亡中的活性影响及意义.

方法: 犬12只随机分2组, 每组6只; 建立胆管损伤后狭窄模型, 在犬胆管内分别植入103pd(103钯)放射性支架和普通胆管支架, 采用HE, TUNEL, RT-PCR, 免疫组化检测增殖内膜中胆管平滑肌细胞增殖、凋亡及相关caspase-3, bcl-2和Fas基因表达, 在JEM-1200EX电镜下观察凋亡细胞超微结构变化, 并用计算机图像检测系统检2组胆管腔面积.

结果: 103pd支架组犬胆管组织中caspase-3和Fas基因表达较普通支架组明显(0.44±0.09 vs 0.16±0.02, 83.33% vs50.00%, P<0.05), 出现明显增殖平滑肌细胞凋亡(87.90±7.96 vs 5.60±0.51, P<0.05), 肝外胆管无明显狭窄; 而普通支架caspase-3和Fas基因低表达, 胆管未出现增殖平滑肌细胞明显凋亡, 而肝外胆管有明显狭窄. 103pd支架组犬胆管组织中bcl-2基因表达较普通支架组弱(16.66% vs 83.33%, P<0.05), 且bcl-2基因低表达组犬胆管出现明显增殖平滑肌细胞凋亡, 而且犬肝外胆管无明显狭窄;bcl-2基因高表达组犬胆管未出现增殖平滑肌细胞明显凋亡, 而肝外胆管有明显狭窄.

结论: 103pd放射性支架可以激活caspase-3和Fas基因, 促进犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡; bcl-2基因表达水平与细胞对辐射的敏感性有关, 103pd放射性支架通过降低bcl-2基因表达, 促进犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡, 从而抑制犬肝外胆管狭窄.

关键词: 103pd支架; g射线; Caspase-3; Fas; bcl-2; 凋亡
引文著录: 何贵金, 吴荣, 高沁怡, 许书河, 高红, 姜维国, 蒋涛, 戴显伟, 马凯. 103pd 诱导犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡及对相关基因的影响. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1721-1724
Effect of 103 pd radioactive stent on apoptosis of smooth muscle cells in bile duct and expression of caspase-3, Fas and bcl-2 gene in dogs
Gui-Jin He, Rong Wu, Qin-Yi Gao, Shu-He Xu, Hong Gao, Wei-Guo Jiang, Tao Jiang, Xian-Wei Dai, Kai Ma
Gui-Jin He, Xian-Wei Dai, Kai Ma, Department of General Surgery, the Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Rong Wu, Center of Radiation Therapy, the Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Qin-Yi Gao, Department of Nuclear Medicine, the Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Shu-He Xu, Department of Isotope Research, China Institute of Atomic Energy, Beijing 100050, China
Hong Gao, Tao Jiang, Department of Surgical Experiment, the Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Wei-Guo Jiang, Department of Pathology, the Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Correspondence to: Gui-Jin He, Department of General Surgery, the Second Clinical College of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China.
Received: March 14, 2005
Revised: March 26, 2005
Accepted: April 1, 2005
Published online: July 28, 2005

AIM: To investigate the expression of caspase-3, Fas and bcl-2 gene in g-radiation-induced smooth muscle cells of bile duct.

METHODS: Twelve dogs were randomly divided into 103pd radioactive stent group (PRS, n = 6) and the control group (NC, n = 6). Stenosis models of biliary duct after injury were established. 103pd radioactive and normal stent were transplanted into the dogs of PRS and NC groups respectively. The g-radiation-induced apoptosis of the smooth muscle cells and the expression of Fas, bcl-2 gene were detected by TUNEL and immunohistochemistry respectively. The expression of caspase-3 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

RESULTS: The caspase-3 and Fas gene were highly expressed (0.44±0.09, 83.33% respectively) in dogs of PRS group, and significant apoptosis of muscle cells (87.90±7.96) was observed. There was no marked stenosis in extrahepatic duct. However, caspase-3 and Fas were lowly expressed (0.16±0.02, 50.00% respectively) in dogs of NC group, and no significant apoptosis of muscle cells (5.60±0.51) was observed. Significant difference existed between dogs of PRS and NC group in caspase-3, Fas and bcl-2 expression and the apoptosis of muscle cells (P<0.05). Marked stenosis appeared in extrahepatic duct. The expression of bcl-2 gene was significantly decreased in dogs of PRS group as compared with than of NC group (16.66% vs83.33%, P<0.05).

CONCLUSION: 103pd radioactive stent can increase the expression of caspase-3 and Fas gene and promote the apoptosis of smooth muscle cells of bile duct. The level of bcl-2 expression is associated with the sensitivity of muscle cells to g-radiation.103pd radioactive stent can facilitate the apoptosis of muscle cells by reducing bcl-2 expression, so as to prevent the stenosis of extrahepatic duct.

Key Words: 103pd radioactive stent; g-radiation; Caspase-3; Fas; Bcl-2; Apoptosis
0 引言

Caspase是近年来发现的哺乳动物细胞凋亡相关蛋白酶, 其中最引人属目的是Caspase-3, 他是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[1], 参与g-射线诱导人白血病细胞株HL-60细胞凋亡[2]. 绝大多数的细胞凋亡依赖于caspase基因的激活. 特异性地阻断caspase-3的活性可抑制细胞凋亡的产生[3];Fas表达升高后出现明显的细胞凋亡[4], 辐射可以导致或诱发Fas介导的细胞凋亡. bcl-2为重要的抗凋亡因子, Bcl-2蛋白通过调节线粒体功能而制约着凋亡的发生. 我们在体内探讨g射线促进caspase-3基因和Fas基因表达和抑制bcl-2基因表达引起犬胆管壁增殖平滑肌细胞凋亡[5]预防胆管再狭窄.

1 材料和方法
1.1 材料

健康本地杂种犬12只, 雌、雄不限, 体重15-20 kg由中国医科大学附属第二医院动物实验室提供, 随机分成2组, 每组6只, 先用0.1-0.15 ml/kg 846麻醉药, im麻醉后, 采用上腹纵行切口逐层进入腹腔, 寻找到幽门, 在其下2-3 cm处切开十二指肠壁, 找到胆总管末端开口, 插入球囊导管, 于犬胆总管内, 通过压力泵向球囊内注入生理盐水, 维持压力5 cm水柱, 造成犬胆管黏膜撕裂, 损伤胆总管后抽出囊内液体, 使压力为零. 重复上述损伤2次, 然后退出球囊导管, 用11F释放器将普通镍钛记忆合金支架从胆总管末端开口处释放到胆总管内. 103pd支架植入犬胆管同普通支架组. 103pd支架是用上述镍钛记忆合金支架将103pd由加速器将质子打入103Rh并释放1个中子生成[103Rh(p, h)103pd], 但需经化学方法提纯103pd含量. 103pd的能量在21-23Kev, 释放低能量g射线, 半衰期为17d, 衰变后转为稳定态的103Rh.103pd支架由中国原子能研究院同位素研究所提供, 采用化学电镀方法将上述103pd电镀于支架上, 通过电镀液含103pd的浓度及电镀时间控制支架表面103pd的量以达到金属支架释放低能量g射线所需浓度. 共10个103pd支架, 103pd的放射性活度为3.4 mci. 两组动物术后继续喂养, 预防感染治疗3 d, 术后30 d同时处死两组动物, 取出一部分胆管并用40 g/L甲醛溶液固定石蜡包埋, 制备成HE切片, 通过计算机图像分析软件测定以下指标: 两组动物总胆管腔面积, 胆管内膜厚度, 残余胆管腔面积, 狭窄程度[(1-残余管腔面积)/总管腔面积之比], 胆管腔周长.

1.2 方法

凋亡细胞原位标记实验(TUNEL)应用Insite Cell Death Detection kit POD(罗氏公司), 细胞核中有棕黄色浓染的为阳性细胞, 高倍镜下记数单位视野TUNEL阳性细胞数, 3次记数求平均值. 取犬胆管新鲜标本25 g/L戊二醛固定, 4 ℃保存30 min, 用10 g/L锇酸固定2 h, 0.1 mol/L PBS漂洗, 然后用梯度浓度乙醇(30-50-70-80-90-100%)脱水, Epon812包埋剂浸泡包埋, 按电镜常规法制备70 nm超薄切片, 醋酸铀、柠檬酸铅染色, 封片, JEM-1200Ex电镜下观察凋亡细胞超微结构变化.

1.2.1 mRNA分离和caspase克隆及序列测定: 分别用总RNA提取试剂盒TRIzol Rengent(GIBCO公司)和mRNA提取试剂盒Poly Attract(Promega公司)按说明分离纯化mRNA.mRNA转录成cDNA, 以其为模板, 用简并引物半巢式-PCR扩增. 引物序列: 上游:5'-CAAAATGGATTATCCTGAAATGGG-3';下游:5'-CCAGGAATAGTAACCAGGTGC-3';扩增片段:510 bp. 序列分析按试剂盒(70770 Sequenase Version 2, 0 DNA Sequencing Kit, Amersham 公司)说明书进行. RT-PCR产物的半定量分析用ΦΧ174-HincII和ΦΧ174/HaeIII为分子质量标准, 取PCR产物10 mL在20 g/L的琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 紫外灯下观察电泳结果, 照相并存入计算机凝胶分析系统, 以GAPDH吸光度值标化caspase-3的吸光度值, 得到caspase-3的相对含量.

1.2.2 Fas免疫组化: 试剂盒购自武汉博士德生物公司. DAB显色, 用兔抗Fas基因抗原的抗体, Fas免疫组化染色后细胞质呈棕褐色的为阳性细胞, 细胞质无棕褐色染色的为阴性细胞. 阳性细胞记数分3级: 低倍镜(10×)1 cm2视野阳性细胞数小于1/3为(+), 1/3-2/3为(++), 大于2/3为(+++).

1.2.3 bcl-2免疫组化: 试剂盒购自武汉博士德生物公司. DAB显色, 用兔抗bcl-2基因抗原的抗体, bcl-2免疫组化染色后细胞质呈棕褐色的为阳性细胞, 细胞质无棕褐色染色的为阴性细胞. 阳性细胞记数分3级: 低倍镜(10×)1 cm2视野阳性细胞数小于1/3为(+), 1/3-2/3为(++), 大于2/3为(+++).

统计学处理 所有数据均用平均数±标准差表示, 定性指标用χ2检验, caspase-3采用计算机SAS软件系统进行t检验.

2 结果
2.1 胆管壁平滑肌细胞凋亡和超微结构

103pd支架组平滑肌细胞凋亡数(87.9±7.96)较普通支架组(5.6±0.51)明显增多(图1A), 二者有显著差异(P<0.05). 普通支架组犬胆管组织平滑肌细胞核大, 核均匀细致, 胞质内有丰富粗面内质网和线粒体. 103pd支架组凋亡的平滑肌细胞可见细胞凋亡的特征性形态学变化: 细胞核缩小, 染色质凝集, 细胞表面形成许多球形突起(起泡), 突起内见被包裹的胞质与细胞器、核的碎片或整个浓缩的细胞核, 部分突起与细胞脱离, 形成凋亡小体(apoptotic bodies), 凋亡小体自细胞一端开始出现, 小体内细胞器结构仍完整, 细胞崩解成多个有膜包绕的圆形凋亡小体, 有的细胞凋亡小体被邻近的细胞吞噬(图1B).

图1
图1 术后 30 d 103pd支架组犬胆管组织平滑肌细胞凋亡. A: 核呈棕褐色染色(×400); B: 凋亡小体被细胞吞噬.
2.2 caspase-3 mRNA的表达

普通支架组(0.16±0.02)犬胆管组织中caspase-3 mRNA表达的量明显低于103pd支架组(0.44±0.09)(P<0.05), 而103pd支架组犬胆管组织中caspase-3 mRNA表达的量较高(图2).

图2
图2 术后30 d 103pd支架组和普通支架组犬胆管组织caspase-3 mRNA表达. 3, 4, 9, 10, 12, 15为103pd支架组;1, 2, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 16为普通支架组, Marker为ΦΧ174-HincⅡ.
2.3 Fas和bcl-2的表达

普通支架组犬胆管组织中Fas基因表达的明显低于103pd支架组, 二者有显著差异(P<0.05), 而103pd支架组犬胆管组织中Fas基因有较高的表达. 普通支架组犬胆管组织中bcl-2基因表达的明显高于103pd支架组, 二者有显著差异(P<0.05), 而103pd支架组犬胆管组织中bcl-2基因有少量的表达(表1).

表1 Fas和bcl-2在犬胆管组织中表达(n = 6).
分组表达(+++)表达(++)表达(+)表达(-)阳性细胞表达率%
Fas103pd支架组2(2/6)3(3/6)0(0/6)1(1/6)83.33
Fas普通支架组0(0/6)1(1/6)2(2/6)3(3/6)50
bcl-2 103pd支架组0(0/6)0(0/6)1(1/6)5(5/6)16.66
bcl-2普通支架组1(1/6)3(3/6)1(1/6)1(1/6)83.33
2.4 胆管组织形态分析

球囊扩张30 d后, 同普通支架组比较, 103pd支架组胆管最大内膜厚度显著减少(78.33%, P<0.01). 普通支架组和103pd支架组胆管最大狭窄面积百分比分别为(56.54±22.32)%和(23.47±15.65)%, 两组具有极显著性差异(P<0.01).103pd支架组胆管腔周长及胆管腔面积均比对照组明显增加(88.24% P<0.01, 91.52% P<0.01)(表2).

表2 胆管内放射对球囊扩张术后30d胆管形态学和胆管狭窄的影响(n = 6, mean±SD).
分组最大内膜厚度(mm)胆管狭窄程度(%)胆管腔周长(mm)胆管腔面积(mm2)
普通支架1.86±0.1454.73±21.646.94±1.373.48±1.75
103pd 支架0.78±0.1217.61±14.529.66±1.585.31±1.94
3 讨论

caspase家族成员在细胞凋亡执行阶段发挥重要功能, 其家族成员都是以酶原的形式存在的, 经过水解激活形成异二聚体催化域而产生活性, 可对多种蛋白底物进行降解, 在凋亡信号传递过程中起关键作用, 是凋亡的执行者[6].caspase-3通过降解ADP-核糖多聚合成酶(PARP)导致核内核酸内切酶的激活, 从而使核小体间的DNA链水解断裂, 产生凋亡特有的DNA节段化, 特异性地阻断caspase-3活性可抑制凋亡的发生[7]. 本结果表明, 103pd支架组犬胆管组织caspase-3表达较普通支架组明显, 且其表达水平的变化与犬胆管壁平滑肌细胞凋亡的检测结果相一致, 提示在103pd支架组, 辐射引起caspase-3基因活性增加, 从而引起犬胆管损伤后增殖平滑肌细胞凋亡的发生. caspase家族成员以休眠状态酶原的形式存在于正常细胞中, 当接受到死亡信号时被激活, 根据已发现的caspase家族蛋白保守氨基酸序列我们应用两条简并引物, 提取103pd支架组犬胆管组织凋亡的平滑肌细胞mRNA, 反转录PCR, 经简并引物半巢式-PCR, 排除阴性对照出现的扩增产物, 可扩增出参与该凋亡过程的所有caspase cDNA. 我们从103pd支架组犬胆管组织凋亡的平滑肌细胞中扩增出一段caspase-3 cDNA, 充分说明caspase-3参与了103pd支架辐射诱导犬胆管壁平滑肌细胞的凋亡. 我们也发现, 103pd支架组犬胆管组织平滑肌细胞中caspase-3表达明显, 而且103pd支架组平滑肌细胞凋亡数较普通支架组明显增多, 说明103pd支架组伴有较明显的平滑肌细胞凋亡的发生; 相反普通支架组犬的胆管组织平滑肌细胞中caspase-3表达不明显, 平滑肌细胞凋亡数较103pd支架组明显少, 说明普通支架组平滑肌细胞凋亡的发生也不明显, 提示, 辐射通过使caspase-3激活, 引起平滑肌细胞凋亡.

Fas系统与细胞凋亡存在明确关系. 射线照射诱发小鼠胸腺细胞及脾脏T, B细胞凋亡过程中, Fas表达明显升高的小鼠细胞凋亡率也明显升高, 而且首先是Fas表达升高, 而后出现明显的细胞凋亡, 表明了辐射导致或诱发Fas介导的细胞凋亡[8]. 实验显示, 103pd支架组犬胆管壁平滑肌细胞Fas表达比普通支架组明显, 且平滑肌细胞出现明显的凋亡, 表明辐射后犬胆管平滑肌细胞发生了Fas介导的凋亡. bcl-2基因在细胞凋亡调节过程中起重要作用, 他是一种凋亡抑制基因, 可以抑制多种因素包括辐射诱导的凋亡, 故也称为存活, 在正常情况下, 以bcl-2异源二聚体形式存在, 当bcl-2增加时, bcl-2同源二聚体升高, 细胞则趋于存活;bcl-2为重要的抗凋亡因子, 定位于线粒体膜的Bcl-2蛋白质可通过调节线粒体功能而制约着凋亡的发生. 研究指出电离辐射引起DNA分子损伤, 激活P53蛋白发挥转录子作用, 使bcl-2表达下降, 而使caspase-3激活, 从而导致细胞凋亡, Bcl-2蛋白质也是caspase-3的底物之一, 激活的caspase-3通过降解Bcl-2蛋白, 进一步地减少Bcl-2蛋白的量. 以往认为bcl-2抗凋亡的机制有: 抑制膜内Ca+的释放, 具有抗氧化的特性, 组织胞内细胞色素C的释放, 通过抑制白介素-1b转化酶的自身催化而抑制细胞凋亡. 我们的研究结果表明, 在普通支架组犬的胆管组织平滑肌细胞中bcl-2表达比103pd支架组明显, 而具有较明显的犬胆管平滑肌细胞凋亡的103pd支架组bcl-2表达反而不如犬胆管平滑肌细胞凋亡不明显的普通支架组, 提示bcl-2的表达与平滑肌细胞凋亡呈负相关.

caspase-3和Fas在103pd支架组表达比普通支架组表达强, 而球囊扩张术后30 d发现, 103pd支架组胆管腔面积比普通支架组明显增加, 胆管狭窄程度比普通支架组小, 这主要是由于103pd辐射激活Caspase-3蛋白酶和Fas基因, 引起增殖平滑肌细胞凋亡, 从而减轻胆管损伤后胆道愈合过程中的管腔狭窄, bcl-2在103pd支架组表达比普通支架组表达弱, 但其具有较明显的犬胆管平滑肌细胞凋亡, 而球囊扩张术后30 d发现, 103pd支架组胆管腔面积比普通支架组明显增加, 胆管狭窄程度比普通支架组小, 这主要是由于103pd辐射抑制bcl-2基因表达, 诱导增殖平滑肌细胞凋亡, 从而减轻胆管损伤后胆道愈合过程中的管腔狭窄, 进一步说明了胆管内放射治疗对胆管损伤后胆管狭窄有明显的作用.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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