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世界华人消化杂志. 2005-07-28; 13(14): 1713-1716
在线出版日期: 2005-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i14.1713
三氧化二砷注射液对胰腺癌细胞系PC-3的体外作用
刘静冰, 秦叔逵, 李进
刘静冰, 秦叔逵, 中国人民解放军第八一医院全军肿瘤中心 江苏省南京市 210002
李进, 上海复旦大学医学院附属肿瘤医院 上海市 200032
刘静冰, 女, 1975-04-06生, 江苏省睢宁县人, 汉族, 2001级南京中医药大学中西医结合肿瘤内科硕士.
基金项目: 南京军区医学科研"十·五"计划课题, No. 02MA014.
通讯作者: 秦叔逵, 210002, 江苏省南京市杨公井34标34号, 中国人民解放军第八一医院全军肿瘤中心肿瘤内科. qinsk@csco.org.cn
电话: 025-84453932 传真: 025-84453906
收稿日期: 2005-02-14
修回日期: 2005-03-04
接受日期: 2005-03-22
在线出版日期: 2005-07-28

目的: 探讨三氧化二砷(亚砷酸, As2O3)注射液对人类胰腺癌细胞的生物学效应及其作用机制.

方法: 采用MTT法观察不同浓度的As2O3对人类胰腺癌细胞株PC-3细胞生长的抑制作用; 以流式细胞术观察细胞的凋亡率及生长周期的变化; 以透射电镜观察其超微结构的变化; 以免疫组织化学的方法, 观察凋亡相关基因蛋白(Fas, Fas-L, Bcl-2和Bax)表达的变化.

结果: 不同剂量(1、2和4 mg/L)的As2O3均可抑制PC-3细胞的增殖, 且抑制率具有浓度和时间依赖性; 流式细胞仪检测显示明显的凋亡峰出现, 并使细胞周期主要被阻滞在S期(14.86-63.66%); 电镜观察显示了药物作用后的癌细胞具有明显的凋亡特征性改变: 细胞膜完整、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成等; 免疫组化研究表明As2O3注射液对PC-3细胞表达的凋亡相关基因具有一定调节作用, 即可下调Bcl-2(+++~+)的表达, 上调Fas(+~+++)、Fas-L(-~+++)的表达.

结论: As2O3注射液对人类胰腺癌细胞株PC-3具有较强的直接抑制作用, 可以诱导癌细胞凋亡, 这可能与其能够调节癌细胞的Fas, Fas-L和Bcl-2等基因蛋白的表达密切相关.

关键词: 三氧化二砷; 胰腺癌; MTT法; 流式细胞术; 免疫组化
引文著录: 刘静冰, 秦叔逵, 李进. 三氧化二砷注射液对胰腺癌细胞系PC-3的体外作用. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1713-1716
Effect of arsenic trioxide on pancreatic carcinoma cell line PC-3 in vitro
Jing-Bing Liu, Shu-Kui Qin, Jin Li
Jing-Bing Liu, Shu-Kui Qin, Oncology Center of Chinese PLA 81st Hospital, Nangjing 210002, Jiangsu Province, China
Jin Li, the Affiliated Tumor Hospital, Medical College, Shanghai Fudan University, Shanghai 200032, China
Supported by: Nanjing Military Region, No. 02MA014.
Correspondence to: Shu-Kui Qin, Cancer Center of PLA 81st Hospital, No.34, 34 Biao, Yanggongjing Street, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China. qinsk@hotmail.com
Received: February 14, 2005
Revised: March 4, 2005
Accepted: March 22, 2005
Published online: July 28, 2005

AIM: To explore the biological effect of arsenic trioxide (As2O3) on human pancreatic carcinoma cell line PC-3 and its mechanism.

METHODS: MTT assay was used to observe the inhibitory actions of As2O3 on PC-3 cells at various concentrations. The apoptotic rate and growth cycle of the cells were detected by flow cytometry. The changes of the cells ultrastructures were observed under electron microscope. The expression of apoptosis-related gene protein (Fas, Fas-L, Bcl-2, Bax) was detected by immunohistochemical staining.

RESULTS: As2O3 inhibited the proliferation of PC-3 cells in a concentration- and time-dependent manner. Marked apoptosis peak was observed and the cells were mainly blocked in S phase (14.86-63.66%). PC-3 cells showed obvious feature of apoptosis under electron microscope, such as intact cell membrane, pyknosis of chromatin, nuclear fragmentation and apoptotic body formation. Bcl-2 protein was weakly expressed (+++) in controls, but strongly expressed (+) in As2O3-treated cells. Fas-L protein were weakly (+) and negatively (-) expressed in controls respectively, but strongly expressed (+++) in As2O3-treated cells.

CONCLUSION: As2O3 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human pancreatic carcinoma cell PC-3 and the mechanism is probably related to its effect on the regulation of Fas, Fas-L and Bcl-2 expression.

Key Words: Arsenic trioxide; Pancreatic carcinoma; MTT assay; Flow cytometry; Immunohistochemistry
0 引言

胰腺癌(pancreatic carcinoma)[1-4]是胰腺的外分泌性腺癌, 为临床常见的消化系统恶性肿瘤, 其发病率占全部恶性肿瘤的1-2%, 并呈逐渐增加的趋势; 因本病的预后极差, 死亡率几乎与发病率接近, 而被称之为癌症的王中之王. 吉西他滨(Gemcitabine, GEM, 双氟胞苷, 健择)[5-8]在减轻患者疼痛和改善生活质量方面具有一定的作用, 可使中位生存期从3.5 mo延长至4.5 mo, 虽然其客观有效率仅11%, 与5-Fu相比并没有明显提高, 对于多数患者疗效仍然不能令人满意, 而且价格昂贵. 三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3, 亚砷酸)注射液治疗APL疗效突出, 在原发性肝癌[9-15]的研究和临床应用上亦取得可喜的成果, 显示出良好的前景, 但As2O3与胰腺癌[16-20]的研究仍处于初期阶段, 仅见个别文献. 我们以人类胰腺癌细胞株PC-3作为模型, 研究As2O3注射液对胰腺癌细胞的生物学效应及其作用机制, 希望为胰腺癌的临床治疗提供一种新的有效药物.

1 材料和方法
1.1 材料

人类胰腺癌细胞株PC-3, 引种自北京协和医科大学协和医院病理科. 将细胞接种于无菌培养瓶中, 加入适量RPMI1640培养液(含150 mL/L的小牛血清、青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L), 于37 ℃、50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中培养. 细胞呈单纯贴壁生长, 每3-5 d传代1次. 亚砷酸(As2O3)注射液: 哈尔滨伊达药业有限公司上市药品.

1.2 方法

将对数生长期的细胞按1×109/L接种于培养瓶中, 待细胞完全贴壁后(约4-5 h), 给药组加入不同浓度的药物, 阴性对照组加入等体积的培养液, 培养至预定时间, 用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态学改变. 取2×107/L的活细胞接种于96孔培养板中, 待细胞贴壁后, 加入不同浓度的药物培养至预定时间, 每孔加入5 g/L的MTT 20 mL, 继续培养3 h, 弃上清, 每孔加入二甲亚枫(DMSO)100 mL, 波长570 nm处测出用药后24、48、72 h各孔吸光度值(A). 并计算细胞生长抑制率(%) = (1-加药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%. 取1.0×106的活细胞接种于培养瓶中, 待细胞贴壁后分别加入终浓度为2 mg/L的As2O3溶液, 置培养箱中培养至预定时间. 消化, 离心, 固定, 加入5 g/L的碘化丙啶(Pro-pidium Iodide)1 mL进行染色, 过滤后, 存放在4 ℃冰箱内20 min后上流式细胞仪检测. 使用软件CELL Quest进行分析. 取1.0×106活细胞接种于培养瓶中, 待细胞贴壁后, 加入终浓度为2 mg/L的As2O3溶液, 培养至预定时间后刮取细胞, 2 000 r/min离心15 min后以40 g/L戊二醛固定、脱水、渗透、包埋、超薄切片, 铀-铅双染色, 透射电镜下观察, 摄片. 收集与As2O3(终浓度为2 mg/L)孵育48 h的PC-3细胞, 固定, 晾干. 按免疫组化试剂盒所示方法(SP法)进行操作. 阳性判断: 以胞质和/或胞膜呈棕黄色为阳性细胞, 油镜下观察200个细胞, 计算阳性细胞百分率. 以阳性率<5%为(-);5-25%为(+);26-50%为(++);>50%则为(+++).

统计学处理 采用SPSS-11软件进行相关资料处理. 统计变量以mean±SD表示, P<0.05表示差异具有显著性.

2 结果
2.1 PC-3细胞的形态学变化

倒置显微镜下观察, As2O3注射液可明显抑制PC-3细胞的生长. 随着与As2O3共同孵育时间的延长, PC-3细胞的增殖逐渐受到抑制, 细胞形态逐渐变圆, 脱壁. 细胞间接触松散, 胞质中颗粒增多, 细胞周围出现碎片, 部分细胞死亡后漂浮在培养液中, 而未用药对照组细胞呈上皮型, 贴壁生长, 细胞轮廓清楚, 细胞间接触紧密, 胞质中无异常颗粒出现, 增殖旺盛(图1).

图1
图1 PC-3细胞的形态学变化. A: 未用药对照组; B: 2 mg/L AS2O2作用24 h; C: 2 mg/L AS2O3作用48 h.
2.2 PC-3细胞生长的影响

MTT法的原理是噻唑蓝在活细胞内线粒体脱氢酶的催化下还原为深蓝色的甲月替, 而死细胞无此作用, 因此可以根据甲月替生成量的多少, 来判断活细胞的数量, 以此观察药物对某种细胞生长的影响. As2O3对PC-3细胞具有明显的抑制作用; 经统计学处理, 相同浓度、不同时间的各组间比较均有显著差异(aP<0.05, 表1); 而相同时间、不同浓度除48 h As2O3 2 mg/L组和4 mg/L组无显著差异外, 其余各组也有显著性差异(bP<0.05); 由此表明As2O3的抑制作用与药物浓度和作用时间呈现一定的依赖关系, 即剂量越大、药物作用时间越长则对PC-3细胞的抑制率越高(图2).

表1 As2O3作用后 PC-3细胞生长的抑制率(%).
As2O3浓度(mg/L)24 h48 h72 h
123.1±1.840.1±2.850.6±3.9
234.1±4.350.6±5.259.7±2.0
443.9±3.756.1±1.567.1±2.4
图2
图2 AS2O3对PC-3细胞生长的抑制率.
2.3 流式细胞术(FCM)分析 2 mg/L

As2O3注射液分别作用12、24、48及72 h后的胰腺癌PC-3细胞, 经流式细胞仪检测, 结果显示对照组细胞的凋亡率为0.21%;As2O3作用组细胞的凋亡率随作用时间的延长而增加, 且随用药时间的延长, S期细胞比例呈上升趋势, 而G0/G1期呈下降趋势; 但在药物作用72 h后, 凋亡细胞的比例反而明显减少, 细胞周期的分布基本等同于对照组细胞(表2).

表2 As2O3对PC-3细胞凋亡及细胞周期的影响(%).
T/h凋亡G0/G1SG2/M
00.260.914.924.2
123.839.523.936.6
2421.938.637.124.3
4827.431.863.74.6
722.187.2012.8
2.4 PC-3细胞的超微结构变化

透射电镜下观察, 未加药的对照组PC-3细胞形态不规则, 大小不一, 胞核较大, 核仁明显, 常染色体丰富, 异染色体紧贴在核膜周边形成一薄层, 细胞膜表面有少量微绒毛, 细胞间出现连接结构, 细胞器丰富, 可见粗面内质网、发达的高尔基体、游离核糖体、小而圆的线粒体以及溶酶体. 而As2O3注射液作用后, PC-3细胞则发生了超微结构的明显改变, 表现为细胞连接和特化的质膜结构消失, 核仁增大, 细胞内出现染色体, 随着药物作用时间的延长, 进一步发展, 细胞表面形成数目不等, 大小不一的细胞突起, 使细胞外形呈星状; 核膜扭曲内摺, 并发生断裂, 使核碎裂为大小不等的颗粒或碎块而分散于细胞中, 胞质内质网扩张, 线粒体形态基本不变, 初期细胞膜保持完整, 继而细胞膜内陷, 至As2O3注射液作用48 h时, 细胞被分割成外有膜包绕的细胞质团块, 其中含有核染色质碎块及细胞器成分, 即典型的凋亡小体(图3).

图3
图3 PC-3细胞的超微结构变化. A: 未加药组; B: AS2O3作用24 h; C: AS2O3作用48 h.
2.5 PC-3细胞凋亡相关基因蛋白的表达

未加药的对照组PC-3细胞, Bax表达强(+++), Bcl-2表达强(+++), Fas表达弱(+), Fas-L表达阴性(-); 经As2O3作用48 h后, Bax仍表达较强(+++), Bcl-2表达弱(+), Fas表达增强(+++), Fas-L表达增强(+++).

3 讨论

三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3, 亚砷酸)是传统中药砒霜的主要成分. 韩云太et al采取静脉注射As2O3注射液治疗急性早幼粒细胞白血病(AML-M3型, 简称APL), 获得突出效果, 该药主要是通过诱导白血病细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用[21-24]. 经As2O3作用后, 通过对胰腺癌细胞生长活力和诱导凋亡情况的动态观察, 我们发现药物作用于细胞后1-3 d内, 细胞抑制率一直随时间的延长而持续上升, 而细胞的凋亡率却在48 h达到较高水平后开始下降, 这提示我们As2O3引起的人胰腺癌细胞死亡是非典型死亡, 即凋亡与坏死现象共存, As2O3在诱导人胰腺癌细胞凋亡的同时也发挥了一定的细胞毒作用; 另一原因可能是在凋亡后期发生继发性细胞膜改变而成为继发性坏死. 通过流氏细胞术发现, As2O3可将细胞周期阻滞于S期, 从而阻抑细胞有丝分裂. 透射电镜观察到As2O3作用24 h后, 较多细胞处于分裂期, 核膜消失, 出现染色体. As2O3对细胞周期的影响, 可能是其诱导凋亡的机制之一.

Bcl-2家族[25-26]在细胞凋亡的调控中起着重要的作用, Bcl-2具有抑制细胞凋亡, 延长细胞生命的功能. 在诸多凋亡相关基因中尤显重要, 被看做是细胞凋亡调控的最后共同通路之一. Bax[27-29]是Bcl-2家族的另一成员, 与Bcl-2作用相反, 具有促进细胞凋亡的作用. Fas基因[30-32]也称APO-1或CD95, 是存在于人细胞表面介导凋亡的蛋白质分子, 属于TNF受体和NGF受体家族的成员, 通过与其配体(Fas-L)交联, 即可诱导典型的细胞凋亡. As2O3诱导的人胰腺癌PC-3细胞凋亡存在以上基因主动参与的激活过程. 本研究为临床上应用As2O3注射液治疗胰腺癌提供了科学客观的实验依据.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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