病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-07-28; 13(14): 1696-1699
在线出版日期: 2005-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i14.1696
黑龙江地区乙型肝炎病毒耐药变异与基因型
李迪, 张淑云, 谷鸿喜, 程险峰, 王晓燕
李迪, 谷鸿喜, 哈尔滨医科大学微生物学教研室 黑龙江省哈尔滨市 150086
张淑云, 哈尔滨医科大学附属第二医学院科研实验中心 黑龙江省哈尔滨市 150086
程险峰, 黑龙江省医院南岗分院泌尿外科 黑龙江省哈尔滨市 150001
王晓燕, 哈尔滨医科大学附属第二医学院传染科 黑龙江省哈尔滨市 150086
李迪, 女, 1971-01-19生, 黑龙江省哈尔滨人, 汉族, 2002年哈尔滨医科大学病原学硕士, 现为哈尔滨医科大学病原学博士生, 主要从事肿瘤相关病毒的研究.
基金项目: 日本健康科学基金资助项目, No. 0109; 哈尔滨医科大学博士创新基金项目.
通讯作者: 谷鸿喜, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路194号, 哈尔滨医科大学微生物学教研室. hxgu2432@163.com
电话: 0451-86685122 传真: 0451-86685122
收稿日期: 2005-04-15
修回日期: 2005-04-25
接受日期: 2005-05-06
在线出版日期: 2005-07-28

目的: 探讨黑龙江地区乙型肝炎病毒发生YMDD基因变异与HBV基因型的关系.

方法: 首先HBVA-F6个主要基因型特异性多引物对巢式PCR法对106例接受拉米夫定抗病毒治疗患者的血清HBV DNA进行基因分型和分析. 再采用实时荧光PCR法对标本进行YMDD变异检测.

结果: 在106例标本中有8例为B基因型, 其阳性率为7.6%;有94例为C基因型, 其阳性率为88.7%;4例为D基因型, 其阳性率为3.8%. 从106例血清标本中检测出63例YMDD发生变异占59.4%, 其余43例为野生型YMDD. 在8例B基因型的标本中, 有5例发生YMDD变异, 变异率为62.5%;在94例 C基因型的标本中, 有55例发生YMDD变异, 变异率为58.5%. HBV B, C两基因型间的YMDD变异率无显著性差异(P>0.05). 在5例B基因型YMDD变异的标本中, 有1例发生YIDD变异(20%), 其余4例发生YVDD(YMDD+YVDD)变异占80%;在55例C基因型YMDD变异的标本中, 有26例发生YIDD(YMDD+YIDD)变异占47.3%, 17例发生YVDD(YMDD+YVDD)变异占30.9%, 12例发生YIDD+YVDD变异占21.8%. HBV B, C两基因型间的YMDD不同变异类型发生率无显著性差异(P>0.05).

结论: 在黑龙江地区拉米夫定抗病毒治疗2-4年, HBV YMDD变异率为59.4%;HBV B, C基因型标本间发生YMDD变异率及基因变异类型均无显著性差异.

关键词: 乙型肝炎; 基因型; 拉米夫定; YMDD基因变异; 耐药
引文著录: 李迪, 张淑云, 谷鸿喜, 程险峰, 王晓燕. 黑龙江地区乙型肝炎病毒耐药变异与基因型. 世界华人消化杂志 2005; 13(14): 1696-1699
Drug-resistant mutation andgenotype of hepatitis B virus Heilongjiang Province
Di Li, Shu-Yun Zhang, Hong-Xi Gu, Xian-Feng Cheng, Xiao-Yan Wang
Di Li, Hong-Xi Gu, Department of Microbiology, Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Shu-Yun Zhang, Experimental Center, the Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Xian-Feng Cheng, Urinary Surgery, the Provincial Hospital of Heilongjiang, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China
Xiao-Yan Wang, Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by: Japan Health Science Foundation, No. 0109 and Doctor Foundation of Harbin Medical University.
Correspondence to: Hong-Xi Gu, Department of Microbiology, Harbin Medical University, 194 Xuefu Road, Nangang District, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China. hxgu2432@163.com
Received: April 15, 2005
Revised: April 25, 2005
Accepted: May 6, 2005
Published online: July 28, 2005

AIM: To determine the relationship between YMDD mutation of hepatitis B virus (HBV) and HBV genotypes during lamivudine treatment.

METHODS: HBV genotypes were determined by nested polymerase chain reaction (PCR) with six pairs of HBV genotype-specific primers (A to F). Then YMDD mutations were detected by real-time fluorescent PCR in serum specimens from 106 hepatitis B patients receiving lamivudine therapy.

RESULTS: Of 106 serum specimens, there were 8 samples belonging to genotypes B (7.6%), 94 genotypes C (88.7%), and 4 genotypes D (3.8%). Sixty-three YMDD mutations were found (59.4%) and the other 43 were YMDD of wild type. The mutant rates of YMDD were 62.5%(5/8) and 58.5%(55/94) in genotypes B and C respectively and no significant difference existed between them (P>0.05). Of 5 genotypes B with YMDD mutations, 1 YIDD (YMDD+YIDD) mutation (20%) and 4 YVDD (YMDD+YVDD) mutations were found. Of genotypes C with YMDD mutations, there were 26 YIDD mutations, (47.3%)17 YVDD mutations (30.9%) and 12 YIDD+YVDD mutations (21.8%). No significant differences were manifested in YMDD mutant types between genotypes B and C (P>0.05).

CONCLUSION: The mutant rate of YMDD is 59.4% after 2-4 years of treatment with lamivudine. The mutant rates and types show no significant differences between genotype B and C of HBV in Heilongjiang Province.

Key Words: Hepatitis B Virus; Genotype; Lamivudine; YMDD mutation; Drug resistance
0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus, HBV)引起的乙型肝炎呈世界性分布. 全球感染者及病毒携带者达3.5亿. 我国是乙型肝炎高发区, 感染HBV的人约有1.2亿. 拉米夫定是核苷类药物, 从病毒学、生化学和组织学等方面改善慢性乙型肝炎患者的病情, 能降低患者血清中HBV DNA水平, 能改善肝功以及肝纤维化程度, 并能获得一定比率的HBeAg血清转换[1]. 对HBV复制有明显的抑制作用, 使乙肝治疗有了新的进展. 但患者长期使用后可产生耐药现象, 常伴随谷丙转氨酶(ALT)反跳, 甚至少数患者可出现病情急性恶化[2]. 现认为主要原因是由于出现HBV多聚酶(P)基因YMDD基序发生变异所致. 产生的HBV变异株可使病毒对拉米夫定的敏感性降低, 影响疗效, 甚至使拉米夫定的临床应用受到很大限制[3]. 由于HBV不同分离株之间核苷酸序列有差异, 目前根据差异性HBV已被分为A-H 8个基因型, 不同的基因型分布有地域性, 而且基因型与病毒复制、变异、疾病的预后及治疗药物的选择均有一定的关系[4-8]. 我们探讨拉米夫定抗病毒治疗中出现的HBV耐药变异与基因型之间的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

2003-01/2005-01哈尔滨医科大学附属第二院传染科住院及门诊患者血清标本106份. 其中慢性肝炎73例, 代偿期肝硬化33例. 男78例, 女28例, 平均年龄38.5±15.6岁; 均接受拉米夫定治疗, 每天口服100 mg, 服用24-48 mo, 均未接受其他抗病毒治疗. 检测YMDD变异的试剂, DNA提取液Ⅰ, Ⅱ由深圳市匹基生物工程股份有限公司生产;Taq DNA合成酶、d NTP购自Promega公司; 引物由北京赛百盛公司合成;DNA标准分子质量购自北京天为时代有限公司. HBV基因型引物的设计, 参照文献[9].

1.2 方法

采用基因型特异性多引物对巢式PCR法对HBVDNA基因分型. 第1次PCR反应体系40 mL, 以HBV DNA 2 mL为模板. 循环参数:95 ℃ 10 min预变性;94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环;72 ℃ 延伸7 min. 第2次PCR分A, B两组进行, PCR反应体系40 mL, 以第1次PCR产物2 mL为模板. 循环参数:95 ℃ 10 min预变性;94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环;72 ℃延伸7 min. 取待检测血清标本和DNA提取液Ⅰ各100 mL, 振荡混匀, 13 000 g离心10 min, 弃上清. 加入25 mL DNAⅡ提取液, 振荡混匀, 2 000 r/min离心10 s.100 ℃干浴10 min, 13 000 g离心10 min, 保留上清备有. 用RocheLigh Cycle荧光PCR仪检测YMDD, 可单独或同YVDD/YIDD.

统计学处理 采用SPSS 10.0软件, 率的比较用χ2检验.

2 结果
2.1 HBV DNA基因型

在281 bp处出现阳性条带为B基因型, 在122 bp处出现阳性条带为C基因型(图1), 119 bp处出现阳性条带为D基因型(图2). 在106例标本中有94例为C基因型, 8例为B基因型, 4例为D基因型. 检测结果, HBV C基因型为主占88.7%, 其次为B基因型占7.6%, D基因型只占3.8%.

图1
图1 HBV基因B, C型电泳图. 1: HBV基因B型; 2: Marker 600 bp; 3: HBV基因C型.
图2
图2 HBV基因D型电泳图. 1 HBV基因D型; 2: Marker 600 bp.
2.2 YMDD变异

在106例标本中有43例为野生型YMDD占40.6%, 发生YMDD变异有63例占59.4%. 发生YMDD变异的63例, 其中发生YIDD变异25例占39.7%, YVDD变异18例占28.6%, YIDD+YVDD变异13例占20.6%, YMDD+YIDD变异4例占6.4%, YMDD+YVDD变异3例占4.8%. 在发生YMDD变异的63例标本中, 有5例为B基因型, 55例为C基因型, 3例为D基因型. HBV B, C基因型YMDD变异率分别为 62.5%, 58.5%. 二者经统计学处理无显著性差异(χ2 = 0.02, P = 0.9>0.05).D基因型因例数少未进行统计. 在5例B基因型变异的标本中, 有1例发生YIDD变异占20%, 4例发生YVDD(YMDD+YVDD)变异占80%;在55例C基因型变异的标本中, 有26例发生YIDD(YMDD+YIDD)变异占47.3%, 17例发生YVDD(YMDD+YVDD)变异占30.9%, 12例发生YIDD+YVDD变异占21.8%. HBV B, C两基因型间的YMDD基因变异类型(YIDD, YVDD)无显著性差异(χ2 = 1.6, P = 0.2>0.05). 另外, D基因型的标本因例数少未进行统计.

3 讨论

HBVYMDD变异率随着拉米夫定治疗时间延长而增加[10], 治疗1, 2, 3年后YMDD变异率分别约为16%-32%, 47%-56%和69%-75%. 来自亚洲的研究表明, YMDD变异率在拉米夫定治疗1, 2, 3年后, 分别达到15%, 38%和53%[11]. 本组106例患者接受2-4年拉米夫定的治疗, HBVYMDD变异率59.4%, 与文献报道基本一致. 在体外的实验中, 发现YIDD变异株的复制能力比YVDD变异株的复制能力强, YIDD变异是YVDD变异的中间产物, 并且YIDD变异出现频率高于YVDD[12]. 本组, YIDD变异出现频率为39.7%, 而YVDD变异出现频率为 28.6%, 与文献报道相一致.

近年来, 众多研究者致力于探寻发生耐药变异的预测因素, 但未达成共识. 如果能明确哪些因素与YMDD变异有关, 可减少或延迟YMDD变异的出现, 以期提高拉米夫定的疗效. 目前许多研究大多集中在YMDD变异出现的时间, 变异的类型以及YMDD变异与ALT水平, DNA 载量, HBeAg阳性率的相关性等方面上, 但缺少YMDD变异与HBV基因型之间关系研究. 病毒的基因型反应了HBV自然感染发生变异的特点, 是病毒变异进化的结果. HBV基因型与病毒的感染途径, 基因突变, 疾病的进程, 抗病毒药物的疗效有一定相关性[13]. 基因型分布有地域性, 我国以B, C型为主, 还有少量A, D型. 南方以B基因型为主, 北方地区以C型为主[14-15]. 感染HBV后的临床经过与不同基因型有关. C基因型与慢性肝病有关, B基因型在急性肝炎中占主要地位[16]. 对黑龙江地区106例慢性乙肝(73)和肝硬化患者(33)的血清进行分析, 结果是C基因型占88.7%, B基因型占7.6%, D基因型只占3.8%, 与文献报道一致. 国外研究表明[17-19], 慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定治疗, YMDD变异累计发生率与HBV基因型(A, B, C型)无相关性, 但耐药患者Ba亚型明显多于Bj亚型. 在我国贵阳地区对87例接受拉米夫定治疗的患者研究结果显示该地区以B基因型为主, 但发生耐药变异率较高的却是C型[20]. 在本实验中, 有5例B基因型, 55例C基因型发生YMDD变异;YMDD变异率分别为62.5%, 58.5%. 在黑龙江地区HBV B, C基因型YMDD变异率无显著性差异(χ2 = 0.02, P = 0.9>0.05). 国外文献报道, D基因型易发生YIDD, A基因型易发生YVDD, 这提示YMDD变异类型可能与基因型相关[21]. 但本实验结果, 在黑龙江地区HBV B, C两基因型间的YMDD基因变异类型(YIDD, YVDD)无显著性差异(χ2 = 1.6, P = 0.2>0.05). 因本实验D基因型例数少, 只涉及HBV B, C两基因型.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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