应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因

摘要

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库, 克隆前-X反式激活相关基因, 了解该段基因的可能生物学功能.

方法: 构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X, 转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照; 提取转染后细胞的mRNA, 反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR), 将产物与pGEM-Teasy载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.

结论: 应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: January 17, 2005
Revised: May 20, 2005
Accepted: May 25, 2005
Published online: July 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)为3.2 kb部分双链的DNA病毒, 其基因组结构紧密, 特点为结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠.1979年Gelibert et al首次报告了HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF): P、前-S/S、前-C/C和X.研究者对这一界定沿用至今.关于这一紧密DNA结构中是否存在新的编码序列, 一直没有进行系统的研究.在1990年代曾有日本学者报道在X基因上游存在一段新的基因, 但并未对该基因的真实性及生物学功能进行研究[1].我们课题组通过分子流行病学研究、上游启动子活性鉴定, 确定了前-X基因存在的真实性, 并利用分子生物学技术对其功能进行了研究[2-4].为了研究HBV感染肝细胞之后, 前-X基因编码的前-X蛋白对于肝细胞的基因表达谱的影响, 我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达前-X蛋白的肝母细胞瘤细胞系HepG2的基因表达类型进行了差异比较.

1 材料和方法

1.1 材料

肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞及大肠杆菌DH5α(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen), FuGENE6转染试剂(Roche), TRIZOL提取试剂(LIFE TECHNOLOGIES), poly A T tract mRNA Isolation system Ⅲ试剂盒(Promega), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒(Clontech), 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Promega), pGEM-Teasy载体(Promega).真核表达质粒pcDNA3.1(-)-前X由本室构建.DNA序列测定由上海申友公司完成.

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体的细胞转染及mRNA提取: 用FuGENE6转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-前-X及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.使用QuikPrePmico mRNA Purification试剂盒从HepG2细胞中直接提取重组表达质粒及空载体的HepG2细胞的mRNA, 经分光光度计分别进行定量分析.

1.2.2 消减杂交文库的建立: 采用PCR-Select cDNA Subtraction Kit, 常规SSH方法按说明书进行: 以转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA), 并分别标记为Tester和Driver, dscDNA经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的内切酶)消化, 产生相对较短的平端片段, 纯化酶切产物.将Tester的dscDNA分为两份, 分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 然后与过量的Driver dscDNA进行杂交; 合并两种杂交产物后再与Driver dscDNA作第2次杂交; 然后将杂交产物做选择性PCR扩增, 使Tester dscDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增.

1.2.3 消减文库扩增及克隆分析: 扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化DH5α感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37℃培养18 h.挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 证明含有插入片段后(200-1 000 bp), 测序.应用生物信息学将测得序列与GenBank数据库进行在线同源性分析(http://www.ncbi.nlm.gov/blast/blast.cgi).

2 结果

2.1 mRNA的定性、定量分析

紫外分光检测显示, 转染了真核表达质粒及空载体的HepG2细胞提取mRNA分别为3.2 μg和3.6 μg, A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.79. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳mRNA为大于0.5 kb清晰慧尾片状条带, 证实mRNA质量完全满足进行消减杂交的要求.

2.2 cDNA消减文库消减效率的鉴定

以消减及未消减PCR产物为模板, 用G3PDH引物进行PCR扩增, 分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5 μL进行电泳鉴定.结果显示: 与未消减组PCR产物相比, 消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少, 说明所构建的消减文库具有很高的消减效率(图1).

图1 消减效率分析结果. 1-4: 消减组, 引物为G3PDH3'、5', PCR循环次数分别为18、23、28、33; 5-8: 未消减组, 引物为G3PDH3'、5', PCR循环次数分别为18、23、28、33.

2.3 差异表达cDNA片段的扩增及克隆

杂交产物经两轮PCR扩增后, 菌落PCR扩增结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段, 所获得的85个克隆中几乎均含有插入片段, 这些条带可能代表差异表达的基因片段(图2).

图2 部分克隆菌落PCR鉴定电泳图.

2.4 cDNA 测序与同源性分析结果

挑选30个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较.其中13个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(96-100%)(表1).

表1 阳性克隆与GenBank已知功能基因同源序列比较结果.

已知基因	相同克隆数	同源性
A174线粒体	2	100%
细胞核核糖体A1	1	95%
RNA结合蛋白	3	94%
核糖体蛋白L31	1	100%
NEDD5	1	99%
跨膜4超家族成员1	2	100%
胎盘绒毛细胞表达的mRNA	3	99%

3 讨论

SSH技术是一种以抑制PCR反应为基础, 将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术[5-6].抑制消减杂交技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离, 在分离稀少基因方面比cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法具有明显优势; 一次SSH反应可同时分离到几十到几百个差异表达基因[7-8].

应用软件的蛋白质分析功能分析了前-X基因的完全表达产物.前-X区编码多肽含有5个C, 可能形成多个二硫键, 易于产生新的二级结构.前-X多肽含有24个极性氨基酸, 形成一个亲水功能域, 可能影响到整个蛋白的空间构象.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析, 发现该区域含有多个S, 可能是磷酸化的重要区域, 与细胞内信号转导有关.我们利用SSH技术分别对前-X和全-X对人肝癌细胞系基因表达谱的改变进行了研究, 力图阐述这个新基因的功能.成功构建前-X基因真核表达质粒, 转染HepG2细胞, 利用SSH技术对差异性表达基因进行同源性分析后发现, 上调表达基因包括核糖体, 转膜蛋白等[9-10].转膜蛋白参与肿瘤细胞的转移和细胞间的黏附.上调表达胎盘绒毛细胞中的mRNA, 有3个相同克隆, 是否与HBV垂直传播有关, 值得进一步探讨.

NEDD5是近年来发现的哺乳动物septin蛋白家族中的一个成员, 具有GTPase酶活性.类似于酵母和果蝇的septin蛋白, 与细胞浆移动移动相关.Kinoshita et al[11]研究发现鼠NEDD5基因编码一个41.5 ku的GTP酶, 类似于酵母及果蝇的细胞浆移动必须蛋白-septin蛋白.在细胞分裂间期和后期, NEDD5聚集成纤维状或粒状结构, 有赖于细胞的生长状态.富含NEDD5的纤维可被微注射GTPγS和缺乏GTP结合活性的NEDD5突变体破坏, 提示GTP的水解需要NEDD5的集合装配.富含NEDD5的纤维也可以与肌动蛋白束和局灶性黏附复合物相互作用, 也可被细胞松弛素D、C3酵素及血清饥饿所破坏, 认为NEDD5在细胞间期与基于肌动蛋白的细胞骨架系统由功能性相互作用.从细胞分裂后期至末期, NEDD5则聚积在收缩环附近, 直到最后形成中间体.Vega et al[12]研究神经细胞中NEDD5与胞外复合物之间的关系, 以及NEDD5在分化的pc12细胞中的突触生长中的角色发现, 当应用神经生长因子诱导分化时, 内源性NEDD5在未分化的pc12细胞中富集在核周, 成放射状向外形成锥形.NEDD5与其他septin蛋白家族成员相同, 可与小鼠脑细胞裂解物中的胞外复合物及微管蛋白共沉淀.GTPase缺陷的NEDD5过表达可促使PC12细胞异常突触的生长.这一结果表明NEDD5与其他septin蛋白一起共同与囊泡外复合物及微管蛋白相互作用, 推测NEDD5的GTPase活性可能是神经突生长的重要因素.总之, NEDD5可能为神经细胞极化所必需, 也许在神经细胞分化过程中通过促进囊泡外复合物的功能起作用.目前HBV感染后只有在引起肝性脑病时患者才会出现神经精神症状, 但是在之前有没有神经系统的病变基础, 目前很少有人报道, 而且肝性脑病的发生机制目前仍然处于研究当中, 本文发现前X-蛋白可以激活NEDD5基因的表达, 提示有必要对肝性脑病的发病机制, 以及HBV感染者的神经系统是否存在潜在的或前期的病变进行研究.

总之, 本研究对于前-X基因的分析鉴定, 为前-X和全-X功能的研究, 为进一步了解HBV的发病机理提供了新的方向.

备注

编辑: 王谨晖 审读: 张海宁

参考文献

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