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世界华人消化杂志. 2005-07-15; 13(13): 1597-1599
在线出版日期: 2005-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i13.1597
p14ARF基因在大肠癌中的表达及意义
刘辉, 罗丽明, 倪国文, 李华, 郭建国, 周中银
刘辉, 罗丽明, 倪国文, 李华, 郭建国, 武汉市普仁医院消化内科 湖北省武汉市 430081
周中银, 武汉大学人民医院消化内科 湖北省武汉市 430060
通讯作者: 刘辉, 430081, 湖北省武汉市青山区红卫路本溪街１号, 武汉市普仁医院消化内科. whzzy@tom.com
电话: 027-68868236
收稿日期: 2005-05-08
修回日期: 2005-05-15
接受日期: 2005-05-25
在线出版日期: 2005-07-15

目的: 探讨p14ARF基因在大肠癌中的表达及其生物学意义.

方法: 应用免疫组织化学(S-P)法和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术原位观察60例大肠癌患者的癌组织、癌旁组织和正常组织中p14ARF基因蛋白的表达和细胞凋亡.

结果: 癌组织p14ARF基因的阳性表达相对含量(PU)(9.57±1.03)明显低于癌旁(28.17±5.26, t = 2.51, P = 0.02<0.05)和正常组织(43.76±7.14, t = 3.61, P = 0.006<0.01); 癌旁凋亡指数(AI)(8.51±2.63%)高于癌组织凋亡指数(AI)(5.65±1.76%, t = 2.18, P = 0.04<0.05); p14ARF基因蛋白的阳性表达按患者的性别、年龄、肿瘤大小分组比较各组间无明显区别; 按癌组织的分化程度、淋巴结转移和Dukes分期比较, 低分化组、有淋巴结转移组和Dukes C+D期组的p14ARF基因蛋白表达分别低于高分化组(7.93±1.89 vs 12.76±2.28, t = 2.36, P = 0.03<0.05)、无淋巴结转移组(7.21±1.95 vs 13.12±2.33, t = 2.34, P = 0.03<0.05)和Dukes A+B期组(7.87±1.18 vs 12.03±2.15, t = 2.36, P = 0.03<0.05).

结论: p14ARF基因在大肠癌组织中表达下调, 从而抑制大肠癌的细胞凋亡, 这可能是大肠癌发生、发展的机制之一; p14ARF基因的表达下调与大肠癌的恶性生物学行为有关.

关键词: N/A
引文著录: 刘辉, 罗丽明, 倪国文, 李华, 郭建国, 周中银. p14ARF基因在大肠癌中的表达及意义. 世界华人消化杂志 2005; 13(13): 1597-1599
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: May 8, 2005
Revised: May 15, 2005
Accepted: May 25, 2005
Published online: July 15, 2005

N/A

Key Words: N/A
0 引言

INK4a/ARF基因位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21), p14ARF是INK4a的可变读框基因, 由三个外显子E1β、E2、E3和两个内含子组成, 三个外显子共同编码分子质量为14 kd的蛋白(即p14ARF), 其由133个氨基酸组成, 能诱导细胞周期阻滞于G1或G2期, 是第一个直接调控细胞周期并抑制细胞分裂的新型抑癌基因[1-2].p14ARF是一种重要的凋亡调控基因, 其独特的结构和生物学功能在肿瘤分子生物学研究中日益受到重视.大肠癌是常见的严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率均较高, 尤其是近年, 由于人们的饮食结构和生活方式的改变, 其发病率正在逐年增加[3-4].细胞凋亡受到抑制是大肠肿瘤形成的重要原因之一[5], 而p14ARF在大肠癌中的表达及意义尚不完全清楚.我们通过检测p14ARF蛋白在大肠癌中的表达, 观察其与细胞凋亡的关系, 探讨p14ARF基因的表达在大肠癌发生、发展和预后中的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

所有标本为武汉普仁医院和湖北省肿瘤医院2000-2004年手术切除大肠癌石蜡标本, 共60例, 其中男性32例, 女性28例, 年龄37-75岁, 平均58±7.8岁.所有病例术前均未行放疗和化疗, 并由两位病理医生确诊.每例取癌组织, 距癌5 cm(癌旁)组织, 距癌10 cm(正常)组织各一块, 中性甲醛(40 g/L)固定, 常规脱水, 石蜡包埋和制备4 μm厚连续切片(切片事先用多聚赖氨酸处理), 切片分别进行HE染色作组织病理学、免疫组织化学研究和TUNEL染色.

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色: 切片脱蜡至水, 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶, 胰酶消化, 采用S-P染色法, 切片置于抗原修复液(0.01 mol/L柠檬酸盐)中微波抗原修复12 min, 100 mL/L羊血清封闭, 加入鼠抗人p14ARF单克隆抗体(抗体购自美国Neomarkers公司), 4℃过夜; 免疫组化染色均按S-P试剂盒推荐方法进行.

1.2.2 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法染色: 按原位凋亡检测试剂盒说明书的步骤检测凋亡细胞(试剂盒购自德国Roche公司).

1.2.3 结果判断: (1)免疫组织化学定量: 采用HIPAS-2000型计算机图像分析系统(同济千屏影像工程公司产品), 摄取放大400倍的图像, 输入图像分析系统.对图像进行灰度变换, 使染色阳性面积与背影分开, 进行自动检测.以测量窗口为固定面积, 对阳性染色及背景的灰度级和面积进行测试, 参照申氏方法[6]计算阳性单位(positive unit, PU), PU代表阳性染色的相对含量.每张切片选5个视野, 求PU均值.(2)细胞凋亡判断及评价标准: 以细胞核呈棕黄色染色者为凋亡细胞.在400倍高倍视野下, 每例标本随机选取5个癌区, 计算凋亡细胞在全部癌细胞中所占的比例, 即凋亡指数(apoptosis index, AI).

统计学处理 应用SPSS10.0软件统计包对数据进行处理, 计量资料以mean±SD表示, 采用t检验.

2 结果
2.1 大肠癌、癌旁和正常组织p14ARF基因蛋白表达和凋亡指数

p14ARF蛋白的阳性表达主要为胞质和胞膜着色, 部分胞核着色, 为浅黄和棕黄色, 染色均匀.阳性细胞多呈局灶样分布, 少数呈散在分布.取阳性细胞局灶样分布处作图像分析测PU值.p14ARF在大肠癌旁和大肠癌中的表达(PU值)均明显低于正常结肠组织, 二者之间差异均有显著性(P<0.05), 在癌旁和癌组织中的表达差异亦有显著性(P<0.05), 癌组织中的表达(PU值)低于癌旁组织.免疫组织化学定量分析见表1.凋亡阳性细胞在组织中为单个散在或簇状分布, 核物质呈现棕黄色.大肠正常黏膜凋亡细胞数量很少, 多位于表层上皮中.癌组织和癌旁组织呈散在分布.癌旁和癌组织凋亡指数(AI)分别为8.51±2.63%和5.65±1.76%, 二者比较差异有显著性(P<0.05).

表1 大肠癌、癌旁、正常组织中p14ARF蛋白表达、AI的比较(mean±SD).
项目癌组织癌旁组织正常组织
p14ARF(PU)9.57±1.03a28.17±5.2643.76±7.14
AI(%)65±1.76a8.51±2.631.75±0.49
aP<0.05 vs 癌旁组织和正常组织.
2.2 p14ARF蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系(表2)
表2 大肠癌p14ARF蛋白表达与病理参数的关系(mean±SD).
临床病理参数组别np14ARF PU
性别男329.95±1.87
女288.96±1.06
年龄<55208.92±1.16
≥554010.36±1.37
肿瘤长径(cm)<3269.15±1.29
≥3349.78±1.16
组织学类型高中分化管状腺癌3512.76±2.28a
低分化管状腺癌257.93±1.89
淋巴结转移无3313.12±2.33c
有277.21±1.95
Dukes分期A＋B2712.03±2.15e
C＋D337.87±1.18
aP<0.05 vs 低分化管状腺癌组;
cP<0.05 vs 淋巴结转移组;
eP<0.05 vs C＋D组.

p14ARF蛋白的阳性表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、无相关性(P>0.05), 与癌组织的分化程度、淋巴结转移和Dukes分期相关(P<0.05), 低分化组、有淋巴结转移和Dukes C/D期的p14ARF蛋白表达低于相对应组别(P<0.05).

3 讨论

大肠癌的发生发展是一个多基因参与, 多步骤的复杂过程.分子生物学研究表明, 肿瘤是一种癌基因的激活和抑癌基因失活的基因病[7].在人类肿瘤细胞中, p53-mdm2-p14ARF这条分子通路的作用日益受到重视[8].p53通路在调控人类肿瘤发生的过程中有两种情况: 细胞凋亡和细胞周期阻滞于G1期和(或)G2期[9-10].p53和mdm2基因研究较多, 其在肿瘤组织中的表达和意义比较明确.INK4a/ARF基因是1993年Serrano et al[1]采用酵母双杂交筛选法研究与CDK4结合的蛋白时发现的第一个直接调控细胞周期并抑制细胞分裂的新型抑癌基因, 是除p53基因之外人类肿瘤中最常见失活的抑癌基因座.他定位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21), 可编码两种抑癌基因: P16INK4a和p14ARF.有关p14ARF基因的研究, 目前报道不多.

我们运用免疫组化的方法显示p14ARF在大肠正常黏膜中表达较强, 在癌旁组织中有部分表达, 较正常黏膜组织阳性细胞少, 染色较弱, 在癌组织中阳性细胞相对较少, 即p14ARF蛋白在大肠癌旁组织和大肠癌中分别存在着不同程度的缺失, 在大肠癌组织中较癌旁组织中缺失较多.提示p14ARF的缺失与大肠癌的发生、发展有明确的关系.这与在脑恶性肿瘤、肺癌和乳腺癌等中的研究报道是一致的[11-13].

在评估p14ARF蛋白表达和大肠癌各临床病理学参数的关系时, 本实验提示p14ARF蛋白表达与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小等无显著关系, 但与组织分化程度、淋巴结转移和Dukes分期存在着高度的相关性, 分化程度低、有淋巴结转移和Dukes分期为C/D期的p14ARF蛋白表达明显低于对应组(P<0.05), 这提示p14ARF蛋白表达与大肠癌的恶性生物学行为有关, 上述结果提示p14ARF虽然参与了大肠癌的发生, 但他的缺失对大肠癌的发展和浸润的作用更大, 这与国外报道的结果是一致的[14].p14ARF蛋白在大肠癌组织中表达的减少, 影响了P53通路信号的传导, 使其对大肠癌细胞的生长抑制作用减弱, 在一定程度上促进了大肠癌的发生、发展.这也说明p14ARF表达的降低对于大肠癌的诊断和预后的判断具有一定的价值.

ARF位点的失活, 常常导致ARF肿瘤抑制功能的丧失, 诱发肿瘤的形成[15].因此ARF与肿瘤的形成相关, 他参与细胞的增殖, 生长, 凋亡.Radfar et al[16]研究表明ARF缺失以及P53缺失的鼠前B细胞中不表现凋亡特征.本实验结果显示, 正常大肠黏膜的凋亡细胞位于表面上皮内, 癌组织和癌旁组织则散在分布, 癌旁组织细胞凋亡指数高于癌组织, 提示p14ARF蛋白表达下调可能与大肠癌细胞的凋亡抑制有关, 这可能是其参与大肠癌发生的机制之一.

编辑: 张海宁

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