炭疽芽孢在巨噬细胞RAW264.7内的萌发过程

摘要

目的: 确定炭疽杆菌A16R芽孢在巨噬细胞系RAW264.7内萌发的过程.

方法: 用炭疽杆菌A16R芽孢以MOI 20∶1感染RAW264.7, 分别于吞噬后1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8 h取细胞爬片进行复红美蓝染色, 显微镜观察.

结果: 吞噬后2-2.5 h, 细胞内的芽孢开始萌发并形成繁殖体; 吞噬后3.5-4 h,繁殖体开始二分裂; 吞噬后5-5.5 h,繁殖体进入指数增长阶段; 吞噬后7-8 h,大量的繁殖体充斥于细胞内、外, 细胞开始崩解.

结论: 首次采用复红美蓝染色确定了A16R炭疽芽孢在巨噬细胞RAW264.7内的萌发过程.

关键词: 炭疽芽孢杆菌; 巨噬细胞; 萌发; 复红美蓝染色

Germination process of Bacillus anthracis endospores within macrophage RAW264.7

Ting Li, Heng-Liang Wang, Zhao-Xing Shi, Er-Ling Feng, Run-Yan Liu, Liu-Yu Huang

Ting Li, Heng-Liang Wang, Zhao-Xing Shi, Er-Ling Feng, Run-Yan Liu, Liu-Yu Huang, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Bioengineering, Beijing 100071, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30470100.

Correspondence to: Dr. Heng-Liang Wang, Beijing Institute of Bioengineering, State key laboratory of pathogen and biosecurity, 20 Dongda Street, Beijing 100071, China. wanghl@nic.bmi.ac.cn

Received: May 8, 2005
Revised: May 18, 2005
Accepted: May 25, 2005
Published online: July 15, 2005

Abstract

AIM: To confirm the germination process of Bacillus anthracis A16R endospores within murine macrophage RAW264.7

METHODS: Macrophage RAW264.7 cells were infected by Bacillus anthrax A16R (pXO2-) spores at a multiplicity of infection (MOI) of 20∶1. Then the cells were harvested at different time points (1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 and 8 h after infection). The growth of infected cells was observed under light microscope by fuchsin basic methylene blue staining.

RESULTS: The endospores began to germinate and develop into vegetative bodies 2 to 2.5 h after infection. The vegetative bodies entered the phase of binary fission 3.5 to 4 h after infection. At 5 to 5.5 h, the bacillus proliferated into exponential phase andthe macrophages began to lyse 7 to 8 h after infected.

CONCLUSION: For the fisrt time, fuchsin basic methylene blue staining is used to study the germination process of Bacillus anthracis endospores within macrophage RAW264.7.

Key Words: Bacillus anthracis; Germination; Fuchsin basic methylene blue staining; Macrophage

0 引言

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)系统性感染是致命性的.炭疽芽孢首先被感染部位的巨噬细胞吞噬并由其携带至附近的淋巴结, 随后芽孢在巨噬细胞内存活、萌发进而形成繁殖体, 后者很快从巨噬细胞内释放并扩散进入淋巴系统、血液循环系统, 在那里迅速地繁殖并释放大量毒素(致死毒素(LT)和水肿毒素(ET))从而引发菌血症、脓毒血症和休克, 最终导致宿主死亡[1].巨噬细胞不仅是机体内最早和炭疽芽孢作用(噬菌作用)的细胞, 还能够诱导宿主产生针对病原菌侵袭的防御反应, 并在炭疽感染过程中介导细胞毒作用[2-5].为了研究宿主细胞在芽孢萌发过程中不同时段的全局性反应, 准确界定炭疽芽孢在萌发过程中结构、功能改变的时间点(段)就成为了全面研究宿主反应机制的必要前提.我们采用复红美蓝染色简便而有效地确定了A16R芽孢在巨噬细胞内急性感染时萌发形成繁殖体的过程, 为今后从基因表达谱和比较蛋白质组等多种角度开展炭疽芽孢感染的宿主反应机制研究奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

亚甲基蓝、碱性品红、石碳酸等试剂均购自北京化学试剂公司; 小牛血清购自Hyclone公司; DMEM培养基购自Gibco公司; 细胞培养板购自Costar公司; HF safe 900/C＋型生物安全柜为上海力新实业有限公司产品; 3K12离心机为Sigma公司产品; E600生物显微镜为Nikon公司产品; 成像系统为Spot公司产品.小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7购自协和医科大学基础医学细胞中心, 炭疽芽孢杆菌A16R(pXO2^-)为本室保存.芽孢的制备、纯化和计数参照文献[6]挑取芽孢杆菌A16R单菌落接种于LB液体培养基, 37℃, 200 r/min培养4 d后, 经复红美蓝染色、镜检, 当芽孢数达80%以上开始收集.4℃ 10 000 g离心10 min, 弃上清, 用灭菌纯水重悬沉淀后65℃水浴30 min杀灭残余的繁殖体, 灭菌纯水重复离心洗涤10次, 去除繁殖体碎片.取少量芽孢溶液进行平板稀释计数以确定活芽孢浓度, 并将芽孢浓度固定在10¹¹/L左右, 4℃保存.以上操作均在生物安全柜内进行.

1.2 方法

细胞培养和芽孢吞噬试验参照文献[7]稍作修改, 小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7用含有100 mL/L小牛血清和100 mg/L的氨苄青霉素和链霉素的DMEM培养基于37℃, 50 mL/L CO₂, 饱和湿度培养至80%融合.胰酶(2.5 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA, pH7.2)消化, 血球计数板计数.在6孔细胞培养板中放置20 mm×20 mm灭菌盖玻片, 共3块培养板.按 5×10⁵细胞/孔的数量将细胞接种于已放置了盖玻片的培养孔中, 用无双抗的含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基于37℃, 50 mL/L CO₂, 饱和湿度培养24 h.次日, 吸出培养孔中的培养基, pH7.2 PBS漂洗3次.按照感染比(MOI)20∶1加入A16R芽孢的DMEM悬液, 100 μL/cm², 即800 μL/孔, 置37℃, 50 mL/L CO₂, 饱和湿度培养30 min, 并开始计时.弃去芽孢悬液, PBS洗3遍, 加入含2.5 g/L庆大霉素的DMEM溶液, 作用30 min.弃去培养基, PBS洗3遍后, 添加新鲜无血清DMEM继续培养.分别于添加芽孢后1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8 h取出一张细胞爬片, 进行复红美蓝染色.将上述爬片用PBS漂洗3次, 纯水漂洗1次, 20 s.吹干, 甲醇固定10 min, 石碳酸复红(100 mL 30 g/L 碱性品红的950 mL/L酒精溶液和90 mL 50 g/L石碳酸水溶液混匀, 滤纸过滤)染色40 min, 水洗, 950 mL/L酒精脱色30 s, 水洗, 碱性美蓝(30 mL 10 g/L亚甲基蓝的950 mL/L酒精溶液和100 mL 0.1 g/L的氢氧化钾水溶液混匀, 滤纸过滤)染色1-2 min, 水洗去除多余染料, 干燥.封片方法如下: 950 mL/L酒精1 min, 2次; 无水乙醇脱水1 min, 2次; 二甲苯透明1 min, 2次.采用Nikon E600生物显微镜进行油镜观察, 图像采集应用Spot CCD系统完成.以上试验重复2次.

2 结果

通过复红美蓝染色法, 有效地确定了炭疽杆菌A16R芽孢按照MOI 20∶1的比例感染鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7后, 其在巨噬细胞内的萌发过程.染色结果显示, RAW264.7细胞吞噬A16R芽孢1 h后, 细胞内存在大量的红色芽孢(红色箭头所示), 说明A16R芽孢被成功吞噬但尚未形成繁殖体.吞噬后2-2.5 h, 细胞内少量芽孢开始萌发, 并开始呈现出繁殖体才能染上的蓝色(黑色箭头所示).吞噬后3 h, 细胞内萌发的芽孢数量逐渐增多, 萌发的芽孢开始膨胀.吞噬后3.5-4 h, 细胞内出现典型的繁殖体并开始二分裂.吞噬后4.5-5 h, 细胞内进入二分裂的繁殖体逐步增多, 并开始生长至胞外.吞噬后5.5 h, 繁殖体进入指数生长阶段.吞噬后6-6.5 h, 繁殖体在巨噬细胞内/外快速增殖, 呈典型的竹节状.吞噬后7-8 h, 大量的繁殖体充斥于细胞内/外, 胞内空泡增多, 逐渐崩解, 细胞脱落, 出现细胞毒效应(图1).最后, 需要指出一个客观事实即所有被吞噬的芽孢其在细胞内萌发和生长的进程并不可能完全一致, 而我们所观察到的结果是该时段的最早发生的或者代表性的事件.

图1 RAW264. 7细胞感染炭疽芽孢A16R芽孢后不同时段的复红美蓝染色结果. A: 1 h; B: 2 h; C: 2.5 h; D: 3 h; E: 3.5 h; F: 4 h; G: 4.5 h; H: 5 h; I: 5.5 h; J: 6 h; K: 6.5 h; L: 7 h; M: 7.5 h; N: 8 h.

3 讨论

感染性疾病是病原微生物和宿主紧密相互作用的结果, 只有深入了解病原微生物与宿主相互作用的分子细节才可能鉴定出病原微生物的所有毒力基因、全面理解病原微生物的致病机制和宿主的防御机制.巨噬细胞是炭疽芽孢萌发和毒力体现的关键宿主细胞, 因此开展巨噬细胞反应机制的研究对于理解炭疽感染机制和宿主免疫机制意义重大.国外已有文献报道了多种菌株炭疽芽孢在巨噬细胞内存活、萌发的研究, 而国内在这方面却鲜有报道.另外, 本试验所采用的A16R(pXO2^-)是我国特有的无荚膜水肿型活芽孢疫苗株, 其皮肤炭疽的保护率为80%-100%, 但对死亡率高的肺炭疽保护效果不佳, 其机制如何尚无报道, 因此开展对炭疽杆菌A16R和巨噬细胞相互作用的研究不仅有利于深入了解炭疽感染的分子机制, 还将为A16R疫苗的改良提供帮助.

炭疽芽孢感染巨噬细胞是一个动态的过程, 准确界定炭疽芽孢在感染模型中结构、功能改变的时间点(段)是全面研究宿主反应机制的前提.已有文献采用了免疫荧光-激光共聚焦显微镜[5-6]、透射电镜[7]以及常规革兰染色[7-8]等方法检测了几株炭疽芽孢在巨噬细胞内的萌发情况, 但都存在着过程繁琐或者不能同时显示芽孢和繁殖体等缺陷.因此, 我们考虑能否应用芽孢染色法来检测芽孢在巨噬细胞内萌发的过程.常用的芽孢染色法包括孔雀石绿染色、Moller染色以及复红美蓝染色等, 但前两种染色过程都需要加热, 不适用于细胞爬片的染色.我们采用染色过程温和的复红美蓝染色法, 对吞噬后的芽孢和萌发的繁殖体进行了清楚地着色(芽孢呈红色和繁殖体呈蓝色), 从而简便、有效地确定了A16R芽孢在巨噬细胞RAW264.7内的萌发过程, 并为今后通过基因表达谱分析和比较蛋白质组等方法对宿主细胞在芽孢萌发不同时段的全局性反应进行研究奠定了基础.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

参考文献

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