高脂饮食性脂肪性肝炎大鼠肝脏线粒体损伤和ATP储备改变

摘要

目的: 探讨高脂饮食大鼠脂肪性肝炎模型肝脏线粒体损伤和三磷酸腺苷(ATP)储备的改变.

方法: SD大鼠随机分为模型组(n = 48)和对照组(n = 24), 分别给予高脂饲料和标准饲料喂养, 分批于实验8、12、16和24 wk处死.常规检测血清生化和肝匀浆ATP含量, 光镜和电镜观察肝脏组织学改变.

结果: 与对照组相比, 模型组肝脏8 wk时肝脂肪变明显, 表现为单纯性脂肪肝, 12-24 wk进展为脂肪性肝炎; 模型组肝脏ATP含量呈减低趋势, 16-24 wk时较对照组减低约1/3(P<0.05); 电镜下8wk模型组大鼠肝细胞线粒体肿胀、增大, 部分内膜嵴粒脱落, 16 wk和24 wk大鼠线粒体内有类圆形结晶样物质沉积.

结论: 高脂饮食大鼠脂肪性肝炎模型的肝细胞存在线粒体损伤和ATP储备的减低.

关键词: 非酒精性脂肪性肝炎; 线粒体; 三磷酸腺苷

Hepatocyte Mitochondrial Injury and the Change of Adenosine Triphosphate Storage in Rat Nonalcoholic Steatohepatitis

Xiao-Dong Ding, Jian-Gao Fan, Zeng-Jie Xu, Xiao-Ying Zeng, Li-Yan Tian, Guo-Lin Wang

Xiao-Dong Ding, Department of Gastroenterology, Xinhua Hospital, Shanghai 200092, China

Jian-Gao Fan, Zeng-Jie Xu, Xiao-Ying Zeng, Li-Yan Tian, Guo-Lin Wang, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080, China

Correspondence to: Jian-Gao Fan, Department of Gastroenterology, Shanghai, First People's Hospital, Shanghai 200080, China. fanjg@citiz.net

Received: November 18, 2004
Revised: November 28, 2004
Accepted: December 9, 2004
Published online: July 15, 2005

Abstract

AIM: To investigate the mitochondrial injury and change in adenosine triphosphate (ATP) storage in a rat model of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) induced by fat-rich diet.

METHODS: Seventy-two male SD rats were randomly divided into two groups. The control group (n = 24) was fed with normal diet; the model group (n = 48) was fed with fat-rich diet, which is consisted of 10% lard oil + 2% cholesterol. 6 or 12 rats were sacrificed at the 8^th, 12^th, 16^th and 24^th wk of the experiment. Serum biochemical parameters were measured by a commercial laboratory. The hepatic histologic change was evaluated by light microscopy and transmission electron microscopy. The ATP content was measured by luciferin-luciferase method.

RESULTS: Simple fatty liver was observed in the model group at the 8^th wk. From the 12^th wk to 24^th wk, the liver gradually progressed to steatohepatitis. The ATP content of the liver was reduced in the model group compared with normal group at the 16^th wk [(2.97±0.48)10^-8 μmol/g vs (2.25±0.55)10^-8 μmol/g, P = 0.0 361, t = 2.354] and the 24^th wk [(2.97±0.48)10^-8 μmol/g vs (1.99±0.66)10^-8 μmol/g, P = 0.0 053, t = 3.439]. Markedly abnormal morphology was observed in the hepatocyte mitochondria in model group, including swelling, rounding, loss of cristae, and stacks of intramitochondrial paracrystalline inclusion bodies.

CONCLUSION: The hepatocytic mitochondria in NASH were injured and the storage of ATP was reduced, which may contribute to the pathogenesis of NASH.

Key Words: Nonalcoholic steatohepatitis; Mitochondria; Adenosine triphosphate

0 引言

随着非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatoh-epatitis, NASH)发病率的增高[1-4], 针对NASH的研究越来越多.能量供应超过机体需要时, 大量转化为脂肪蓄积在机体内, 当超过外周脂肪组织的蓄积能力后, 易脂解为游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)进入血液, 运输到肝脏, 经过β氧化转化为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)储备在肝细胞内.线粒体在β氧化中发挥核心作用, 如果线粒体损伤导致脂肪酸代谢障碍, FFA便酯化为三酰甘油(triglyceride, TG)蓄积在肝脏, 导致肝细胞内脂滴增多, 发生肝细胞脂肪变.为此, 我们动态观察NASH形成过程中肝脏线粒体超微形态改变和ATP储备情况, 以明确他们在NASH发病中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠72只, 购自中科院上海实验动物中心斯莱克公司, 体质量150(140-160)g.胆固醇, 上海生化试剂商店.猪油, 自备.血清生化指标通过Bayer 1650全自动生化分析仪检测.荧光素酶-荧光素、标准ATP粉剂和荧光素酶系缓冲液: 中科院上海植物生理研究所.低温离心机: Sigma公司, TR-16R.透射电子显微镜: 飞利浦透射电镜CM120.FG-100型发光光度计: 中科院上海植物生理研究所.SD大鼠正常喂养1 wk后, 随机分为2组.对照组24只用普通饲料喂养, 模型组48只以20 g/kg胆固醇＋100 g/kg猪油＋880 g/kg标准大鼠用饲料构成的高脂饲料喂养.实验开始后8、12、16和24 wk分别处死6只对照组和12只模型组大鼠.所有大鼠处死前夜禁食, 以氯胺酮麻醉, 腹主动脉采血后取肝, 称量肝脏湿质量, 之后迅速从肝脏切取1块肝组织, 中性甲醛固定后制备石蜡切片, 同时一小块肝脏标本标记后液氮罐中冷冻保存, 并取2 mm³的肝脏组织一块戊二醛固定后行电镜检查.

1.2 方法

血清ALT、AST、TG和总胆固醇(TC), 采用全自动生化分析仪检测.肝组织石蜡切片HE染色观察肝病理学变化, 根据肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数之比值, 对肝细胞脂肪变进行分级[5-6].肝脏炎症活动度计分(hepatic histologic activity scores of inflammation, HAI)标准分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)、桥接坏死(BN)4项, 计分公式为P+L+2(PN+BN)[7].肝脏经戊二醛固定后, 由LKB V型超薄切片机切片, 枸橼酸铅色片染色, 透射电镜观察肝细胞超微结构的改变, 尤其是线粒体的变化.ATP测定所有试剂均用重蒸蒸馏水配制, 溶液为: (1)腺苷酸提取液(Tris·HCl 20 mmol/L, MgSO₄ 2 mmol/L); (2)荧光素酶系缓冲液: 每只粉剂用50 mL重蒸水溶解, 内含50 mmol/L甘氨酰甘氨酸(pH = 7.6)、10 mmol/L MgSO₄、1 mmol/L EDTA缓冲液.ATP的标准曲线: 将ATP配成1×10^-10-5×10^-5 mol/L的6管应用液进行测定, 以相对发光强度的log值与ATP浓度绘制标准曲线.荧光素酶-荧光素法测定ATP: 取肝组织0.1-0.15 g, 加入1 mL腺苷酸提取液中, 匀浆后沸水中加热3 min, 然后以4 000 rcf/min离心3 min, 取上清液0.4 mL.检测时将肝匀浆液0.1 mL加入重蒸馏水0.1 mL稀释, 置入2 mL的比色杯中, 放入FG-200型发光光度计的暗室中, 从暗室盖的小孔中快速注入荧光素酶系缓冲液0.8 mL, 所记录之发光曲线的初始峰值即为检测样品光强, 测定温度为25℃, 测定电压为0.5 mV.根据所得光强(测定曲线上所占的小格数)后, 在标准曲线上查出ATP值.

统计学处理 计量资料用mean±SD表示, 组间比较采用Student t检验, P<0.05为差别有统计学意义, P<0.01, 为差别有显著性统计学意义, 所有统计采用SPSS11.01(Chicago, USA)软件完成.

2 结果

实验过程中2组大鼠体质量、肝质量和腹腔内脂肪含量均呈进行性增加.从8 wk开始模型组大鼠体质量、肝指数(肝脏湿重/体质量)和腹腔内脂肪指数(腹腔内脂肪含量/体质量)均显著高于对照组(P<0.05), 24 wk升高最明显(P<0.01, 表1).与对照组相比, 在第8-12 wk部分模型组大鼠血清ALT水平明显升高, 16 wk时模型组大鼠血清ALT均值显著增高(P<0.05), 24 wk时增高更为明显(P<0.01); 血清AST水平在造模12 wk开始显著升高(vs对照组P<0.01), 至造模16 wk达高峰.两组大鼠血清TG水平在造模8-16 wk时差异不明显, 但在24 wk时, 模型组与对照组相比明显升高(P<0.05).血清TC水平自造模8 wk始呈增高趋势, 12 wk时差别有统计学意义(P<0.05), 16-24 wk时升高更为明显(P<0.01, 表2).

表1 各组大鼠体质量、肝重、腹腔内脂肪含量改变.

分组	n	体质量(g)	肝重(g)	脂肪质量(g)	肝指数	脂肪指数
正常组8 wk	6	367±34	11.0±1.3	10.3±1.2	0.030±0.003	0.028±0.002
高脂组8 wk	12	403±27a	13.3±1.5b	12.0±1.2b	0.033±0.003a	0.030±0.003
正常组12 wk	6	403±28	12.2±1.0	12.1±2.3	0.029±0.001	0.030±0.004
高脂组12 wk	12	445±43a	16.6±1.9b	14.5±2.0a	0.037±0.002a	0.033±0.002
正常组16 wk	6	469±40	14.8±1.0	14.0±1.8	0.031±0.001	0.030±0.002
高脂组16 wk	12	531±46a	20.1±1.5a	17.4±0.7b	0.038±0.006	0.033±0.002a
正常组24 wk	6	508±33	15.1±1.3	14.8±2.3	0.030±0.002	0.029±0.003
高脂组24 wk	12	573±45a	23.8±1.5b	19.9±2.1	0.042±0.004b	0.035±0.005a

^aP<0.05,

^bP<0.001 vs 对照组.

表2 各组大鼠生化指标改变.

分组	n	ALT(nkat/L)	AST(nkat /L)	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)
正常组8 wk	6	487±25	2 000±283	1.18±0.18	0.60±0.14
高脂组8 wk	12	492±32	2 050±167	1.51±0.10	0.66±0.18
正常组12 wk	6	728±90	1 750±200	1.02±0.10	0.75±0.17
高脂组12 wk	12	864±87	2 534±267b	1.83±0.39a	0.81±0.12
正常组16 wk	6	628±43	2 134±217	1.20±0.38	0.74±0.10
高脂组16 wk	12	1 614±150a	2 951±350b	2.10±0.16b	0.83±0.13
正常组24 wk	6	768±157	2 000±183	1.27±0.61	0.71±0.12
高脂组24 wk	12	2 070±193b	2 700±183b	2.33±0.21b	1.10±0.24a

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.1 肝脏病理学改变

光镜下, 肝组织HE染色显示造模8 wk大鼠肝脏即有弥漫性肝细胞脂肪变性, 以肝腺泡III区最为明显, 87.5%(10/12)达脂肪肝诊断标准, 41.7%(5/12)肝脏小叶内出现轻度炎症细胞浸润和散在的点状坏死.造模12 wk大鼠呈中-重度脂肪肝, 且HAI积分显著高于造模8 wk大鼠(P<0.01, t = 3.2); 所有大鼠均可见到小叶内炎症, 炎症细胞以单个核细胞为主, 伴点状和/或小灶性坏死, 部分标本见数个炎症坏死灶融合成片, 汇管区亦可见到以单个核细胞为主的炎症细胞浸润.16 wk时, 大鼠肝脏内往往数个坏死灶融合成片, 1例出现碎屑样坏死, 1例出现桥接坏死, 汇管区炎症也较重.造模24 wk大鼠仍呈中-重度脂肪肝, 肝脏炎症仍然较重(vs 12 wk模型组P<0.01, t = 8.864, 表3), 与16 wk高脂组相比, 其小叶内炎症略有减轻, 其中1例(1/12)汇管区炎症加剧.透射电镜下, 与正常肝细胞相比(图1A)模型组大鼠肝细胞内充满大量脂滴, 肝细胞核被胞质内积聚的大脂滴推挤, 从肝细胞中央区被推到细胞的周边(图1D).肝细胞线粒体结构异常, 表现为线粒体增大、肿胀、线粒体内嵴粒脱落、减少, 且随着造模时间延长, 线粒体损害加重, 部分线粒体内可以看到类圆形高密度结晶样物质沉积(图1B).模型组24 wk标本电镜下肝脏内发现胶原纤维沉积(图1C).

图1 肝细胞透射电镜扫描结果. A: 正常肝细胞, 细胞核位于细胞中央, 线粒体形态正常, 嵴粒位于内嵴上(×16800); B: 高脂组16 wk肝细胞, 线粒体结构异常, 可见线粒体增大、肿胀、线粒体内嵴粒脱落、减少, 部分线粒体内可以看到类圆形高密度结晶样物质沉积(×9600); C: 高脂组24 wk肝脏内发现胶原纤维沉积(×5700); D: 高脂组大鼠肝细胞内充满大量脂滴, 细胞核被胞质内积聚的大脂滴推挤到细胞的周边(×5700).

表3 各组大鼠肝脂肪变程度和HAI计分.

分 组	n	脂肪变程度				HAI	ATP(10-8 μmol/g)
		-	+	++	+++
对照组	24	21	3	0	0	0	2.97±0.48
高脂组8 wk	12	0	2	5	5	0.67±0.19a	2.45±1.05
高脂组12 wk	12	0	0	4	8	3.82±1.00b	2.27±0.73
高脂组16 wk	12	0	0	0	12	7.36±1.76a	2.25±0.55a
高脂组24 wk	12	0	0	0	12	4.83±1.05b	1.99±0.66b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组.

2.2 大鼠肝脏ATP含量改变

对照组大鼠肝脏ATP含量为(2.97±0.48)×10^-8 μmol/g, 模型组肝脏ATP含量随着造模时间延长呈逐渐下降趋势, 16 wk模型组与对照组相比具有统计学意义(P = 0.036, t = 2.354), 24 wk模型组ATP含量进一步下降, 与对照组比较ATP含量降低约33%, 且差异具有明显的统计学意义(P = 0.005, t = 3.439).相关分析显示, 对照组肝脏ATP含量与体质量之间呈负相关(r = -0.81, P<0.05), 模型组肝脏ATP含量与体质量的相关性不明显(r = 0.35, 0.1<P<0.2); 无论模型组还是对照组大鼠肝指数与肝脏ATP含量之间均没有明显的相关性.

3 讨论

通过高脂饲料喂养雄性SD大鼠, 对肝脏病理变化进行了动态观察, 结果与我们以前造模情况基本吻合, 实验动物出现超质量、高胆固醇血症、中-重度脂肪肝伴以小叶内为主的炎症坏死, 从而通过高脂饲料成功建立了普通SD大鼠的NASH模型[8-10].肝脏是机体能量代谢和转换的中枢器官.线粒体是体内中、长链脂肪酸β氧化的核心细胞器, 其在代谢脂肪酸的过程中产生大量ATP, 为ATP合成的主要细胞器.ATP含量决定了细胞对应激的反应能力, 如果其含量降低, 会导致细胞对应激的反应不足, 引起肝脏的严重损伤, 因此组织中ATP水平是反映组织细胞功能状态及其生命力的重要参数之一[11-12].为此我们动态观察了NASH大鼠模型肝细胞超微结构的改变, 尤其是线粒体形态的改变, 并测定了肝脏ATP的含量, 探讨二者在NASH发病中的可能作用.电镜检查显示, NASH模型组肝细胞中充满大量脂滴, 导致胞核移向细胞边缘, 伴肝细胞线粒体肿胀、变圆、体积增大, 细胞内膜嵴粒部分脱落.随着造模时间的延长, 肝细胞线粒体损伤逐渐加重, 造模16 wk起部分线粒体内见类圆形高密度沉积物.这与国外报道的NASH肝脏线粒体损伤的程度相近, 此时往往同时伴有线粒体ATP合成酶亚单位减少、线粒体产生ROS增多等[13-21].

对肝脏ATP含量的测定结果表明, NASH模型组肝脏ATP储备降低1/3左右.进一步的相关分析显示, 实验大鼠体质量与肝脏ATP含量具有一定的相关性, 这主要见于正常对照组肝脏, 而模型组则没有发现二者之间具有相关性.这一结果与Cortez-Pinto et al[22]在NASH患者所得出的结果相似, 作者发现正常人群肝脏ATP储备与体质量指数(body mass index, BMI)关系密切, BMI越大, 其肝脏ATP含量越低.而发生NASH后的患者, 尽管肥胖, 但其肝脏中ATP储备与BMI的负相关性不明显, 这可能与NASH肝脏ATP储备本身就减少有关.肝脏能量储备不足容易导致肝脏对再次打击的耐受力降低.Cortez-Pinto et al[22]对肝活检证实的8例NASH患者用果糖静脉注射诱发短暂的中等度肝脏ATP耗竭, 注射后15 min二者ATP含量均降到最低值, 60 min时对照组ATP含量恢复到注射前水平; 而此时NASH组ATP含量没有恢复到注射前水平, 直到实验结束其与对照组恢复后的ATP含量相比仍有显著的统计学差异, 说明NASH患者肝脏遭受中等度果糖注射应激后, 其ATP储备恢复能力降低.作者同时发现对照组ATP储备恢复程度与BMI呈负相关, 提示肥胖者肝细胞对应激反应能力不足.Vendemiale et al[23]进行的实验发现脂肪肝大鼠肝细胞线粒体上F0-F1 ATP合成酶的β-F1催化亚单位较对照组减少30%, 其线粒体内ATP含量亦明显降低; 对两组禁食18 h后, 实验组的β-F1亚单位较禁食前明显减少, 而对照组无明显变化, 说明ATP合成的β-F1亚单位减少与肝脏ATP储备降低具有一定的相关性.Caracini et al[24]用ob/ob大鼠诱导的脂肪肝模型进行缺血再灌注试验发现门静脉结扎15 min后, 对照组肝细胞ATP含量降低30%, 而ob/ob大鼠则高达60%, 恢复灌注60 min后对照组ATP含量恢复到缺血前水平, 而ob/ob大鼠则有2只死亡, 存活的4只其ATP含量明显低于基线时的水平.这些实验和我们的实验说明, 脂肪变的肝脏的确存在ATP储备降低, 使肝脏耐受二次打击(如手术、缺血灌注损伤、禁食和果糖应激等)的能力降低.总之, 我们的研究结果提示, 高脂饮食NASH大鼠存在肝脏肝细胞线粒体结构的损伤和ATP储备的减低, 并可能参与NASH的发生和发展.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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