血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗预防大肠癌术后肝转移的实验

摘要

目的: 观察血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗对预防大肠癌术后肝转移的作用.

方法: RT-PCR克隆血管抑素基因, 建立重组腺病毒载体.建立人结肠癌LoVo肝转移种植的模型, 给予血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗.观察其对大肠癌细胞肝转移的影响.

结果: 血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗治疗组肝转移发生率明显低于其他各组(P<0.05), 肝转移瘤数少于其他各组(P<0.05), 荷瘤生存时间长, 治疗组肿瘤组织中血管抑素基因表达为阳性, MVD明显低于其他各组.

结论: 血管抑素的基因治疗与传统的腹腔化疗联合应用, 对预防裸鼠人LoVo结肠癌细胞肝转移有一定的作用.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 12, 2005
Revised: March 25, 2005
Accepted: April 20, 2005
Published online: June 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

大肠癌术后肝转移的发生率甚高[1], 大剂量腹腔化疗对防治术后肝转移有重要的临床意义[2].我们用裸鼠人LoVo结肠癌肝转移模型, 观察血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗对预防大肠癌术肝转移的作用, 为血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗在大肠癌患者的应用提供理论和实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料

各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、M-MLV逆转录酶等均购自华美公司.pJM17质粒、腺病毒LacZ、人胚肾293等购自中科院细胞所.人结肠癌LoVo细胞由中科院上海药物所提供.Balb/c nu/nu裸鼠48只(SPF级), 4-6周龄, 体重18-20 g, 雌雄兼有, 购自中科院实验动物中心, 饲养于上海复旦大学附属医学院实验动物部, 裸鼠置于恒温层流箱中, 于无特定病原体(SPF)环境下饲养.12 h光照和12 h黑夜交替.喂养符合卫生部颁布的"医学实验动物全价营养饲料标准".

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人结肠癌LoVo细胞、293细胞、ECV304细胞于高糖DMEM培养基, 常规添加100 mL/L小牛血清, 青霉素 100 mg/L, 链霉素100 mg/L, 50 mg/L CO₂ 37℃恒温半封闭培养.

1.2.2 RT-PCR克隆血管抑素基因: 一步法提取人肝脏组织RNA.设计针对血管抑素Angiostatin信号肽及编码区的引物: 引物 1: 5'-AGCGAATTCCAAATGGAACATAAGG-3; 引物 2: 5'- AGCCTCGACCTATTACGCTTCTGTTCCTGAC-3', 分别在两条引物中设计了EcoRI和XhoI限制内切酶的点位, 常规进行RT-PCR, PCR产物回收纯化后, 用EcoRI和XhoI酶切, 克隆pcDNA3质粒相应酶切位点, 命名为pcDNA3(AGS), 测序鉴定.

1.2.3 重组腺病毒载体的构建: 将angiostatin基因pcDNA3(AGS)克隆至pAdCMV, 形成pAdCMV(AGS)再与Pjm17质粒采用磷酸钙沉淀法共转染293细胞, 挑取病毒噬斑, 得到pAdCMV-AGS, 扩增, 氯化铯梯度离心钝化, 滴度测定.按同样法构建无基因携带的空病毒载体Ad-null 做对照.病毒转染效率实验和细胞体内增殖实验: 由Ad-LacZ做腺病毒载体转染标记, MTT法测定其感染ECV304 细胞和LoVo细胞的比率.

1.2.4 预防人结肠癌LoVo细胞(HCC)肝转移的实验: Balb/c nu/nu裸鼠48只, 按裸鼠结肠癌LoVo细胞肝转移模型建立方法, 于脾脏上极注入HCC细胞0.03 mL(1×10⁹/L), 随机分成6组, 每组8只, A组对照组(生理盐水(NS)40 mL/kg); B组5-FU组(5-FU 40 mg/NS 40 mL/kg); C组AdCMV- AGS组(CMV 10 μL/NS 40 mL/kg, 即1011pfu/L); D组Ad-null组(CMV 10 μL/NS 40 mL/kg); E组AdCMV-AGS联合5-FU组1(CMV 10 μL和5-FU 40 mg/NS 40 mL/kg); F组AdCMV-AGS联合5-FU组2(5-FU 40 mg/NS 40 mL/kg, 7 d 后腹腔内注射AdCMV-AGS, CMV 10 μL).所有裸鼠于自然死亡或存活60 d后处死, 剖腹观察腹腔内情况, 作肝脏表面肿瘤肉眼计数, 病理检查.观察各组裸鼠荷瘤生存时间、肝转移的发生率、肝转移瘤数, RT-PCR检测血管抑素基因的表达, 免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD).其中荷瘤生存时间大于60 d, 计为60 d; 肝转移瘤数大于100个, 计为100.

统计学处理 结果以均数±标准差(mean±SD)表示, 用SPSS10.0统计软件处理, 数据比较采用一般线性模型进行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 T-PCR克隆血管抑素基因

RT-PCR从肝脏组织中扩增1.1 kb的基因片段, 克隆AGS(pcDNA3), 测序结果同以往文献相同相当于纤溶酶原Kringle-Kringle4的编码区域.

2.2 重组腺病毒载体的构建

将angiostatin基因pcDNA3(AGS)克隆至pAdCMV, 形成pAdCMV(AGS)再与pjm17质粒采用磷酸钙沉淀法共转染293细胞, 挑取病毒噬斑, 得到pAdCMV-AGS, PCR鉴定有Angiostatin基因存在扩增, 氯化铯梯度离心纯化, 测定病毒滴度为10¹³ pfu/L.按同样方法构建无基因携带的空病毒载体Ad-null做对照.病毒转染效率实验和细胞体内增殖实验: 由Ad-LacZ做腺病毒载体转染标记, MTT法测定其感染ECV304细胞和LoVo细胞的比率为100%.

2.3 预防人结肠癌LoVo细胞肝转移的实验(表1)

表1 预防人结肠癌LoVo细胞肝转移的实验结果(mean±SD).

分组	肝转移发生率%	肝转移瘤数	荷瘤生存时间(d)	MVD
A: 对照组	100%(8/8)	50.3±7.5	31.8±5.2	6.21±0.91
B: 5-FU组	75%(6/8)	39.0±5.8	43.5±7.3	5.66±0.68
C: AdCMV-AGS组	87.5%(7/8)	49.6±7.3	32.3±4.6	4.34±0.64
D: Ad-null组	100%(8/8)	47.8±5.4	34.0±7.3	6.49±0.82
E: AdCMV-AGS联合5-FU组1	50%(4/8)	23.1±4.7	47.4±8.1	3.93±0.70
F: AdCMV-AGS联合5-FU组2	75%(6/8)	36.5±6.2	32.4±6.4	4.15±0.87

AdCMV-AGS联合5-FU组1在接种后肝转移发生率明显低于其他各组(P<0.05), 而5-FU组和AdCMV-AGS联合5-FU组2的接种后肝转移发生率明显低于对照组、AdCMV-AGS组和Ad-null组(P<0.05).AdCMV-AGS联合5-FU组1在接种后肝转移瘤数为23.1±4.7, 显著低于其他各组(P<0.05), 而5-FU组和AdCMV-AGS联合5-FU组2的接种后肝转移瘤数低于对照组、AdCMV-AGS组和Ad-null组(P<0.05).AdCMV-AGS联合5-FU组1在接种后荷瘤生存时间为47.4±8.1 d, 显著高于其他各组(P<0.05), 而5-FU组和AdCMV-AGS联合5-FU组2的接种后荷瘤生存时间高于对照组、AdCMV-AGS组和Ad-null组(P<0.05).

RT-PCR检测显示AdCMV-AGS组和两组AdCMV-AGS联合5-FU治疗组的肿瘤组织中血管基因表达皆为阳性.免疫组化检查结果显示两组AdCMV-AGS联合5-FU治疗组肿瘤组织中微血管记数(MVD)明显低于其他各组, 其差异有统计学意义(P<0.05).

3 讨论

血管抑素具有专一靶细胞, 即血管内皮细胞.正常成人的血管内皮细胞只有0.01%进行细胞分裂, 而肿瘤病灶中进行细胞分裂的内皮细胞可达到正常组织的100-1 000倍[3].因此, 血管抑素通过作用于肿瘤血管内皮细胞发挥其强大的抑制肿瘤血管生长的同时对正常组织血管内皮细胞则损伤很小, 是一种高效低毒肿瘤血管抑制剂.

目前认为血管抑素抑制肿瘤血管生成的作用机制可能与以下几个方面有关: (1)增强黏附激酶的活性, 促进内皮细胞的凋亡[4]; (2)诱导蛋白激酶ERK-1和ERK-2脱磷酸化, 降低其生物活性, 从而抑制内皮细胞的增生[5].(3)拮抗碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子的作用, 抑制血管内皮细胞的迁移和毛细血管芽生[6]; (4)与机体内组织纤溶酶原激活物(tPA)非竞争性结合, 减少tPA与纤溶酶原、细胞外基质的结合, 减少纤溶酶生成, 从而抑制血管内皮细胞的迁移和毛细血管芽生[7].

目前动物实验已证实血管抑素对多种肿瘤的生长和转移具有很强的抑制作用, 可抑制乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和恶性胶质瘤等多种肿瘤的形成、增殖和转移, 促使肿瘤细胞的凋亡, 具有很高的临床应用价值.近年来, 已有许多种血管抑素制剂进入I期和II期临床实验, 并取得了良好效果.由于血管抑素在体内代谢快、停用后肿瘤会很快继续生长, 与基因治疗相结合有望解决这一难题.已有学者将血管抑素基因通过脂质体或逆转录病毒载体系统转导入机体或肿瘤组织, 并在机体中检测到高水平的血管抑素, 抑制了肿瘤的生长和转移[8].血管抑素的基因治疗与免疫治疗、放疗、化疗联合作用可产生更强的抑瘤效果.很多研究结果提示血管抑素的基因治疗与传统的抗肿瘤细胞治疗的联合应用, 能更有效地治疗肿瘤, 为实体肿瘤的"双靶向"治疗奠定了实验基础[9].

大肠癌行根治性手术后有较高的复发率[1], 一般认为肿瘤侵出浆膜层种植于腹腔或手术致癌细胞脱落入腹腔而形成亚临床种植转移, 或经门脉系统而形成的肝转移[10], 以及患者手术后免疫功能的低下等因素是复发的主要原因.术后化疗对降低术后的复发率, 延长生存时间有一定的疗效.

大剂量腹腔化疗对防治腹腔转移和肝转移的有重要的临床意义[2].目前认为腹腔化疗有以下几方面的优势: (1)腹腔内局部药物浓度高[11].(2)化疗药物通过门静脉系统吸收入肝脏, 对经门静脉系统转移的癌栓及肝内转移性癌细胞有较强的杀灭作用, 可预防和治疗肝转移癌, 是降低胃肠道肿瘤术后肝转移的重要措施.(3)全身的毒副作用小[12].(4)腹腔化疗操作技术简单, 应用方便[13].我院从1990年开始对进展期胃肠道肿瘤患者术后施行腹腔化疗.通过对我院1992年以来胃肠道恶性肿瘤术后进行经埋入式化疗泵腹腔化疗的826例患者进行回顾性分析研究, 认为经皮下埋藏埋入式化疗泵腹腔化疗, 操作简便, 是理想的腹腔化疗方式[14].

我们对血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗预防大肠癌术后肝转移进行实验研究, 即用裸鼠人LoVo结肠癌细胞肝转移模型, 观察血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗对预防大肠癌术后肝转移的作用.结果显示血管抑素基因联合氟尿嘧啶腹腔化疗组裸鼠的荷瘤生存期较长, 肝转移发生率低, 肝转移瘤的数目也较少, 对预防裸鼠人LoVo结肠癌细胞肝转移有一定的作用.

备注

编辑: 张海宁

参考文献

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