包膜病毒膜融合及其在生物医学中的应用

摘要

病毒结合到宿主细胞表面受体后，启动了病毒融合蛋白的一系列构象变化，暴露出融合肽，使病毒包膜和细胞膜融合.膜融合使病毒蛋白及病毒RNA基因组释放到宿主细胞内而感染宿主.针对包膜病毒进入细胞的分子机制设计抗病毒药物和疫苗，为防治疾病发生开辟了新的思路.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: April 7, 2005
Revised: April 8, 2005
Accepted: April 9, 2005
Published online: June 28, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

病毒侵染细胞的生命周期需要吸附、侵入、脱壳、病毒成分合成、病毒粒子的装配和释放等一系列步骤，这是一个连续的过程，而且这主要针对有包膜的病毒而言.按病毒外壳是否包裹着富含脂质的膜，将病毒分为无包膜病毒和有包膜病毒.无包膜病毒主要通过吞饮作用在网格蛋白的介导下进入被感染的细胞内[1-2]，包膜病毒的入侵过程主要是病毒包膜和宿主细胞膜的融合过程，两个膜融合成为一个膜，从而使病毒侵入，完成生命周期的第一个关键步骤.在分子水平上研究这一过程，找出阻止病毒侵入细胞的方法，达到预防和治疗病毒疾病的目的[3-5].

1 病毒包膜结构

病毒的包膜实际上是病毒外壳包裹着的一层富含脂质的膜，从宿主细胞膜衍生而来，故其反映了宿主细胞膜脂成分.脂质若被脂溶性溶剂溶解，包膜结构即遭到破坏，病毒也就失去感染性[6].病毒包膜上有一种或几种病毒基因编码的包膜蛋白，并且多数为糖基化的糖蛋白.这些糖蛋白的重要功能是介导病毒包膜与细胞膜之间的融合[7].在分子水平上包膜病毒蛋白分为两类，第1类以正黏病毒、副黏病毒、逆转录病毒、丝状病毒与冠状病毒的病毒进入蛋白为代表，其主要特征为融合片段形成了螺旋化的卷曲螺旋.第2类以甲病毒和黄病毒进入蛋白为代表，其有内化融合顺序，与其他的膜蛋白以异源二聚体的形式组装[8].不同包膜病毒膜蛋白结构有很大差异，如流感病毒主要含有两种糖蛋白: 血凝素(HA)、神经酰氨酶(NA)，HA和NA共同介导病毒与宿主的相互作用(即和受体唾液酸结合)，HA具有诱发融合功能[9].人类免疫缺陷病毒(HIV)，其包膜主要糖蛋白为gp160，其被细胞内酶裂解成gp120/gp41，分别具有与靶细胞膜受体分子结合及诱发融合的功能[10].

2 包膜病毒与膜的融合

包膜病毒与膜的融合方式可分为两类，一类为非pH依赖型，其在中性pH下即可发生融合.如HIV、疱疹病毒、冠状病毒、仙台病毒等.另一类为pH依赖型，在pH为5-6的条件下才能发生融合，如流感病毒、水疱型口炎病毒、森林病毒.前者融合先以受体介导的内吞作用，后在胞内体酸性环境下触发融合，后者包膜直接与细胞膜融合.但是无论哪种情况都需要包膜上特异糖蛋白介导[11].以流感病毒和HIV为例，包膜糖蛋白在宿主细胞内以前体蛋白形式合成(流感病毒HA0/HIVgp160)，然后被蛋白酶裂解为两个表面亚单位(HA1/gp120)及跨膜亚单位(HA2/gp41)，表面亚单位用于识别及结合到宿主细胞的特异性受体，跨膜亚单位包含融合肽区域，是病毒融合的功能单位，共同特点是形成同源三聚体，这种结构对维持包膜病毒包膜蛋白完整性和"隐藏"融合肽都十分重要[12].

对包膜病毒来讲，膜融合是一种非常有效的递送病毒至胞质的方式，在膜融合过程中关键一步是病毒包膜蛋白的构象经历显著变化.根据最新提出的亚稳定状态假说[13]: 多种病毒包括脊髓灰质炎病毒、流感病毒等病毒的包膜蛋白处于亚稳定状态，病毒蛋白与受体的结合或pH的改变(或者二者均有，但两个过程均有争议)能提供能量，克服病毒进入时的能量障碍，使病毒达到一个遗传上稳定的有利状态.转变到这种状态的能量使不稳定的病毒蛋白外在化.病毒包膜蛋白结构的转变、内在化不稳定膜序列表现为外在化的活性的过程克服了能量障碍，诱导形成膜孔和膜融合孔.

3 病毒抑制剂、抗体与疫苗

3.1 病毒抑制剂

病毒进入抑制剂在细胞外与病毒结合阻止病毒进入细胞，与靶向胞内的病毒进入机制相比，设计药物相对比较容易，成为药物设计中一个有吸引力的方向，从而防止病毒性疾病发生.在该方面应用HIV-1抑制剂的研究取得了一定的进展[14] .根据HIV-1进入细胞的机制: 当gp120亚基结合CD₄的最外面IgG结构域时，糖蛋白构型发生变化，使病毒和辅助受体CXCR4或CCR5结合，激发gp41亚基具有融合能力.设计的抗HIV-1药物有(1)抗CD4与gp120结合的抑制剂: CD4的类似物; gp120各表位单抗如PRO540、FP21399; 可与CD4结合的分子如PRO2000、BMI-378806[15].(2)阻断gp120与辅助受体结合的抑制剂: AMD3100(CXCR4的拮抗剂)等.张颖et al[16]将HIV-1辅助配体RANTS和SDF-1的逆转录病毒载体转染至人外周血淋巴细胞，在细胞内表达并与HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4结合，以HIV-1 DP1株攻击后没见到合胞体形成; 第4、7、10 d分别发现p24抗原分泌显著地受到抑制.

包膜病毒进入细胞过程中可形成中间过渡态复合物.这种复合物暂时暴露，病毒可能还没进化出靶向这些抑制剂的结构.此外，这些保守的过渡态对病毒来说也是重要的，可使病毒不容易被诱变的其他结构所取代.包膜病毒抑制剂在这方面也取得了进展，如T-20，其来自于HIV gp41羧基末端7个一组的区域，可与gp41 N端结合形成超螺旋，阻止gp41N端形成螺旋发夹结构前体，抑制HIV进入.目前T-20已被美国FDA批准[17]，正进入III期临床.

病毒进入抑制剂研究中一个有前景的方向就是研制结合病毒表面一个相同或不同的蛋白的几个区域的多价抑制剂，从而克服病毒蛋白诱变后逃避抑制剂作用.例如流感病毒和HIV-1多亚基可溶性受体，体外是强效进入抑制剂，体内在抑制病毒方面也起到一定作用[18].Fang et al[19]研制出多价重组抗体融合蛋白受体抑制剂CFY196，其由人化MA1A6 Fab片段和人IgD铰链的一个连接子融合而成，比HRV受体ICAM-1的单抗更能阻止鼻病毒HRV感染.

3.2 中和抗体和疫苗

中和抗体通常可以黏附到细胞或结合至过渡态复合物抑制病毒进入[20].从人血浆中获取的免疫球蛋白已成功用于治疗多种病毒感染，包括抗狂犬病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒等.但机体一旦感染病毒后，治愈率是非常低的，单抗Synagis可高亲和力地结合呼吸道合胞病毒RSV的F蛋白，体内抑制病毒进入和细胞融合.Synagis比目前使用的多克隆免疫球蛋白更有效，广泛应用于临床，治疗A型RSV、B型RSV分离株感染[21].

抗体或衍生物虽然能结合至表位上抑制病毒进入，但是在抗病毒应用方面仍存在潜在问题: 抗体形态相对大、病毒包膜蛋白与受体接触机会有限，这些都会限制抗体分子与病毒结合.通过对鼻病毒和脊髓灰质炎病毒的X-射线晶体结构分析表明，微小RNA病毒能通过受体结合位点2 nm深2 nm宽的峡谷的非保守氨基酸残基的突变来避免抗体的中和作用[22].HIV-1中和抗体体外强有效然而体内效果却不成功，说明目前应考虑从病毒抗原性方面来设计疫苗[23].

4 病毒抑制剂研究中的挑战

同其他抗病毒、抗癌药物研究过程中遇到的困难一样，病毒抑制剂研究中的主要问题也是抗药物突变株的产生、药物体内效率低和药物的毒副作用.此外，病毒进入抑制剂的研制还有特异性困难: (1)病毒进化出了识别受体的机制: 使用可变环、不完全补体结合表面、低聚物的潜伏、糖基化[18]、构象的伪装及多价相互作用来逃避宿主对其的识别[24].(2)用小分子的抑制剂来抑制蛋白-蛋白之间高亲和力的相互作用，抑制效果不很理想.(3)病毒通过直接的细胞间转移抵抗抑制剂.(4)在临床使用中，病毒进入抑制剂的作用机制或治疗方案都没建立在结构模式的基础上，大量的抑制剂仍为小的有机分子、肽和抗体[11].

因此，对包膜病毒进入细胞的分子机制的研究仍是一个非常重大的挑战.现在的主要目标是测定病毒包膜蛋白、相关细胞受体的结构，以便对病毒嗜亲性与致病机制有更详尽的了解.以免疫原作用机制为基础设计疫苗对临床应用有一定的帮助.总之对致病性相关的抗各种包膜蛋白的研究可加速对进入机制的理解，有助于防止病毒性疾病发生.

备注

编辑: 王谨晖 审读: 张海宁

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