P34cdc2﹑Cyclin B1在大肠癌中的表达及意义

摘要

目的: 研究p34^cdc2、细胞周期素B1(cyclin B1)在大肠癌组织中的表达，并探讨其与大肠癌发生、发展的关系.

方法: 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测p34^cdc2、cyclin B1在64例大肠腺癌组织及10例正常对照大肠组织中的表达情况.

结果: 64例大肠癌组织中p34^cdc2、cyclin B1表达阳性率分别为68.75%和82.81%，定位于细胞质中，呈棕黄色或棕褐色.10例正常对照大肠组织中p34^cdc2、cyclin B1部分为弱阳性及中度阳性表达.病例组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05).cyclin B1与p34^cdc2的表达呈正相关，相关系数为0.586.p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中的表达在有淋巴结和远隔器官转移组与没有淋巴结和远隔器官转移组间其差异有显著性(P<0.05);而在根据患者年龄、性别、肿瘤的原发部位、分化程度等进行分组的组间其表达的差异没有显著性.在大肠癌组织中PCNA阳性细胞呈弥漫分布，呈明显异质性，阳性率为73.44%.在正常大肠组织中见PCNA阴性或少量阳性表达.经统计学分析在大肠癌组织中PCNA的表达与p34^cdc2和cyclin B1均没有相关性.

结论: p34^cdc2、cyclin B1在大肠癌中呈过表达，可作为反映大肠癌淋巴结转移和远隔器官转移的指标之一.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: January 6, 2005
Revised: January 25, 2005
Accepted: February 26, 2005
Published online: May 15, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

细胞周期复杂的顺序过程是细胞周期调控因子在细胞周期检测点的控制下，相互作用忠实而有顺序地启动和完成细胞周期事件的过程.对细胞周期调控机制的研究是研究癌变机制的重要内容之一.绝大多数恶性肿瘤细胞都存在遗传物质和(或)细胞周期检验点的异常，将肿瘤细胞的遗传不稳定性固定于肿瘤细胞中，促进肿瘤的发生发展.G2/M期是与细胞恶变有关的重要细胞周期时相，本文对G2/M期调控因子p34^cdc2及细胞周期素B1(cyclin B1)在大肠癌中的表达及意义进行了研究，以期进一步阐明大肠癌发病机制，并为其临床治疗另辟新径.

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集我院2000-2002年间经手术证实的64例大肠癌，其中男性40例，女性24例.年龄24-76岁，平均53.6±10.8岁.术前均未行放、化疗.Duke's分期中A期10例，B期26例，C期17例，D期11例.10例正常的大肠黏膜组织均来源于肠镜活检标本.

1.2 主要试剂和来源

即用型鼠抗人p34^cdc2单克隆抗体购自武汉博士德公司;鼠抗人cyclinB1、PCNA单克隆抗体均购自福州迈新公司;S-P试剂盒购自北京中山公司.

1.3 方法

全部新鲜标本24 h内经10%甲醛固定，常规石蜡包埋.大肠癌蜡块行4 μm厚度的连续切片四张，贴于经多聚赖氨酸处理的玻片上，70℃烘烤2 h，1张行HE染色复查诊断，3张行免疫组化研究.染色方法按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物(SP法)试剂盒说明书步骤进行，石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，30 mL/L H₂O₂ 10 min;微波预处理15 min(微波抗原修复液为pH6.0柠檬酸缓冲液)，PBS洗2 min，3次;10%山羊血清15 min;加一抗4℃过夜，PBS洗2 min，3次;生物素标记二抗10 min，PBS洗2 min，3次;加SP 15 min，PBS洗2 min，3次;DAB显色2-5 min;自来水充分冲洗，苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封固.以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照.

1.4 结果判断

1.4.1 p34^cdc2和cyclinB1: 光镜下每张切片随机选取高倍视野记数500个细胞.按阳性细胞百分数记分，阳性细胞数 = 5%为0分，阳性细胞数 = 6%-25%为1分，阳性细胞数 = 26%-50%为2分，阳性细胞数 = 50%-75%为3分，阳性细胞数>75%为4分;按染色强度记分，无着色记0分，淡棕黄色记1分，棕褐色记2分.两项合并，得0-2分为阴性(-)，3-4分为弱阳性(+)，5-6分为阳性(++)，7-8分为强阳性(+++).

1.4.2 PCNA: 高倍镜下记数1 000个细胞中核染色呈棕黄色的阳性细胞百分数，阳性细胞数 = 10%为阴性，>10%为阳性.

统计学处理 用SPSS统计软件进行χ²检验和Spearman等级相关分析法进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性.

2 结果

2.1 p34^cdc2和cyclinB1以及PCNA在大肠癌组织和正常肠组织中的染色定位

p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织癌细胞中和正常肠组织中定位于细胞质中，呈棕黄色或棕褐色，细胞核无着色.PCNA在正常大肠组织中未见表达，而在大肠癌组织中PCNA阳性物质主要集中于细胞核，阳性细胞呈散在﹑灶状或弥漫分布，且有明显异质性，阳性率为73.44%.

2.2 p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织和正常肠组织中的表达结果

p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中表达阳性率分别是68.75%和82.81%，正常肠组织中的表达阳性率分别是10%和30%，差异有显著性(P<0.05)，即p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中呈过表达.大肠癌组织中cyclin B1和p34^cdc2的表达呈正相关(P<0.05)，相关系数为0.586(表1).

表1 p34^cdc2和cyclin B1的表达.

	p34cdc2表达情况				cyclin B1表达情况
	-	+	++	+++	-	+	++	+++
正常组织	9	1	0	0	7	1	2	0
大肠癌组织	20	14	17	13	11	19	18	16

2.3 p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系

经统计学分析，p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中的表达在有淋巴结和远隔器官转移组与没有淋巴结和远隔器官转移组间其差异有显著性(P<0.05);而在根据患者年龄﹑性别﹑肿瘤的原发部位﹑分化程度等进行分组的组间其表达的差异没有显著性(表2).

表2 大肠癌组织中p34^cdc2和cyclin B1的表达与临床病理特征的关系.

	n	p34cdc2				cyclin B1
		-	+	++	+++	-	+	++	+++
年龄
≤60	39	14	8	8	9	6	10	11	12
>60	25	6	6	9	4	5	9	7	4
性别
男	40	12	9	11	8	5	11	12	12
女	24	8	5	6	5	6	8	6	4
原发部位
直肠	41	13	8	11	9	7	11	12	11
结肠	23	7	6	6	4	4	8	6	5
分化
高	14	6	4	2	2	4	4	3	3
中	37	10	6	12	9	5	10	12	10
低	13	4	4	3	2	2	5	3	3
淋巴结和远处转移a
有	28	5	12	10	1	2	11	13	2
无	36	15	2	7	12	9	8	5	14

^aP<0.05.

2.4 p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中的表达与PCNA的关系

在47例PCNA表达阳性者中，p34^cdc2表达阳性为35例，在17例PCNA表达阴性者中，p34^cdc2表达阴性为8例，组间差异没有显著性(P>0.05)，提示在大肠癌组织中p34^cdc2的表达与PCNA的表达没有相关性;在47例PCNA表达阳性者中，cyclinB1表达阳性为39例，在17例PCNA表达阴性者中，cyclinB1表达阴性为3例，组间差异没有显著性(P>0.05)，提示在大肠癌组织中cyclinB1的表达与PCNA的表达没有相关性.

3 讨论

肿瘤的发生，实质上是一种细胞周期调控上的失控、异常产生了多种生长因子，信号传导途径失常，致使细胞呈失控样增长，这个过程产生的生长因子﹑激素﹑各种蛋白及遗传物质DNA代谢，均通过细胞周期来实现和调控.以分子生物学为基础的细胞周期调控机制主要是:细胞周期蛋白﹑周期蛋白依赖性激酶﹑周期蛋白依赖性激酶抑制物.以周期蛋白依赖性激酶为中心的系统中的任何一个环节出现问题，均会引起细胞周期出现异常，最终导致肿瘤发生.由p34^cdc2和cyclin B1参与的细胞周期和基因转录的合理调控是保持细胞进行正常增殖和分化的必要条件，这一调节过程的异常势必将导致细胞周期紊乱，且与恶性肿瘤的发生、发展有着密切联系[1].一些学者在乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌的研究中发现，普遍存在G2/M期调控因子cyclin B1和p34^cdc2表达的异常.

我们应用免疫组化的方法检测p34^cdc2和cyclin B1在人大肠癌及正常肠黏膜中的表达，发现在大肠癌中p34^cdc2的阳性率为68.75%，cyclin B1的阳性率为82.81%，同时p34^cdc2和cyclin B1在大肠癌组织中的表达均明显高于正常大肠黏膜组织，且过表达的cyclinB1与p34^cdc2呈正相关(P<0.05)，相关系数为0.586，这一结果与国外文献[2]报道基本相似.多数学者支持p34^cdc2的总体分布在间期表达于细胞质中，在分裂前期迁入细胞核中.在正常细胞周期的G2/M阶段，p34^cdc2和cyclin B1分别是经典的CDK(细胞周期素依赖性激酶)和cyclin.G2/M期过渡的关键调节者是p34^cdc2.过表达的p34^cdc2需要与周期蛋白连接和正确的磷酸化而显示活性.大肠癌恶性细胞进入S和G2期时，cyclin B1被合成并累积达到最大浓度.p34^cdc2和cyclinB1形成MPF，在MPF中P34^cdc2起催化作用，cyclin B1起调节作用.在cyclin B1诱导下，p34^cdc2的激活酶-CAK(主要由CDK7和Cyclin H组成)将其磷酸化，p34^cdc2又经历了有丝氨酸/苏氨酸活性的Weel/Mik1的失活的磷酸化.在G2/M期过渡时，磷酸化酶^CDC25C去除使p34^cdc2失活的磷酸化，形成有蛋白激酶活性的p34^cdc2.激活的p34^cdc2/cyclin B1能磷酸化^CDC25C来促进p34^cdc2/cyclin B1的磷酸化，进而形成了cyclinB1/p34^cdc2/^CDC25c自动连锁反馈环，导致MPF在激酶活性上突然呈爆发式增加，继而导致癌细胞过度增殖.但在本次实验中经统计学相关分析发现PCNA的表达与p34^cdc2以及cyclin B1没有平行的相关关系，这可能是由于此次实验例数较少，同时也可能是由于p34^cdc2不仅导致肿瘤细胞的过度增殖，也可能通过PCNA参与肿瘤细胞的凋亡.Deng et al就发现缺乏ATM基因的肿瘤细胞系经射线照射后，ATM基因阻断了^CDC25蛋白的反应性减少，持续活化的p34^cdc2和CDK2顺次激发了细胞凋亡[3].Ouonnor et al也发现p34^cdc2通过与抑制凋亡基因Survivin相互作用参与细胞凋亡[4].

浸润、转移是恶性肿瘤演进的重要特征，也是大肠癌患者不良预后的主要原因，但迄今尚无理想的方法进行早期诊断.本实验通过对过表达的p34^cdc2和cyclin B1与大肠癌临床病理特征的研究，发现p34^cdc2和cyclinB1在大肠癌组织中的表达在有淋巴结和远隔器官转移组与没有淋巴结和远隔器官转移组间其差异有显著性(P<0.05);而在根据患者年龄﹑性别﹑肿瘤的原发部位﹑分化程度等进行分组的组间其表达的差异没有显著性，提示过表达的p34^cdc2和cyclin B1可以作为提示淋巴结转移和远隔器官转移的参考指标.Nozoe et al认为p34^cdc2是大肠癌淋巴结转移的独立相关因子[5].刘标 et al[6]的研究表明鼻咽癌颈部淋巴结转移存在p34^cdc2和cyclin B1的过表达.也有学者发现cyclin B1的过表达提示了食管鳞状细胞癌较差的预后.另一方面Yasuda et al发现cyclin B1的表达与胃癌临床分期和广泛淋巴结浸润呈负相关[7]，Kourea et al[8]也未发现p34^cdc2的表达与乳腺癌淋巴结转移有相关关系.可见p34^cdc2和cyclin B1的表达与恶性肿瘤包括大肠癌的临床病理特征的关系尚不明确，如本实验未得出p34^cdc2与恶性肿瘤分化有关的结论，因而p34^cdc2和cyclin B1如何应用于指导临床诊断还有待进一步研究.

细胞的增殖、凋亡、分化、衰老均是细胞周期依赖性的，因此，选择能同时破坏细胞并引起凋亡的药物以调节细胞周期为其策略将是今后抗癌治疗的新途径[9].G2/M期阻滞是细胞在染色体分离前对损伤的DNA进行必要的修复时期，可减少染色体畸变，避免有丝分裂的失败，并有可能增加细胞对DNA损伤剂的耐受.因此，设计针对细胞G2/M期检测点的药物，可能为改善癌肿治疗的策略提供新思路.

备注

编辑:张海宁

参考文献

1.	Solorzano L, Rieber MS, Rieber M. Lower cyclin H and cyclin-dependent kinase-activating kinase activity in cell cycle arrest induced by lack of adhesion to substratum. Cancer Res. 2000;60:7114-7118.  [PubMed]  [DOI]

2.	Seong J, Chung EJ, Kim H, Kim GE, Kim NK, Sohn SK, Min JS, Suh CO. Assessment of biomarkers in paired primary and recurrent colorectal adenocarcinomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1999;45:1167-1173.  [PubMed]  [DOI]

3.	Deng J, Zhou J, Meng F, Li D, Sun H. Failure to inactivate CDK activity is responsible for the enhanced apoptotic response in U937 cells mediated by silencing ATM gene. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2002;22:193-196.  [PubMed]  [DOI]

4.	O'Connor DS, Grossman D, Plescia J, Zhang H, Villa A, Tognin S, Marchisio PC, Altieri DC. Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:13103-13107.  [PubMed]  [DOI]

5.	Nozoe T, Honda M, Inutsuka S, Korenaga D. P34cdc2 expression is an independent indicator for lymph node metastasis in colorectal carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2003;129:498-502.  [PubMed]  [DOI]

6.	刘 标, 陈 小毅, 苟 新敏. 鼻咽良恶性病变中EBV-LMP1, Cyclin B1, p34cdc2 和Survivin 的表达及意义. 广东医学院学报. 2004;22:10-12.  [PubMed]  [DOI]

7.	Yasuda M, Takesue F, Inutsuka S, Honda M, Nozoe T, Korenaga D. Overexpression of cyclin B1 in gastric cancer and its clinicopathological significance: an immunohistological study. J Cancer Res Clin Oncol. 2002;128:412-416.  [PubMed]  [DOI]

8.	Kourea HP, Koutras AK, Scopa CD, Marangos MN, Tzoraco-eleftherakis E, Koukouras D, Kalofonos HP. Expression of the cell cycle regulatory protein p34cdc2, p21waf1, and p53 in node negative invasive ductal breast carcinoma. Mol Pathol. 2003;56:328-335.  [PubMed]  [DOI]

9.	Blagsklonny MV, Pardee AB. Exploiting cancer cell cycling for selective protection of normal cells. Cancer Res. 2001;61:4301-4305.  [PubMed]  [DOI]