清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导SMMC-7721细胞Raf-MEK-ERK信号传导的影响

摘要

目的: 观察清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞, 对Raf-MEK-ERK信号传导的影响.

方法: 采用血清药理学方法, 以病理鼠血清作对照, 用Western免疫印迹方法检测清肝化瘀方含药血清对Raf、MEK、ERK蛋白表达影响, RT-PCR方法检测清肝化瘀方含药血清对MEK1mRNA表达影响.

结果: 清肝化瘀方含药血清能抑制Raf、MEK、ERK蛋白的表达, 但以抑制MEK蛋白为主(P<0.05), 能抑制MEK1 mRNA的表达(P<0.05).

结论: 清肝化瘀方含药血清能够抑制TGFα诱导的人肝癌细胞增生, 阻断TGFα在细胞内的信号传导.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: September 24, 2004
Revised: October 17, 2004
Accepted: October 22, 2004
Published online: January 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

信号传导在细胞调控中起重要作用, 选择性的阻断肿瘤细胞自分泌或旁分泌的信号传导通路, 破坏其自控性生长调节机制, 正在成为极具吸引力的研究热点. 自研中药清肝化瘀方(半枝莲、白花蛇舌草、苦参、三棱、莪术、黄芪等组成), 以清热解毒、祛瘀散结、健脾理气为治法, 对肝癌患者有抑制肿瘤生长、缓解症状和延长生存期的作用, 基础实验表明他对大鼠肝癌前病变及癌变有明显的阻断作用[1-3], 其机制有待于进一步研究. 我们采用血清药理学方法, 从信号传导的角度, 体外研究清肝化瘀方对转化生长因子α(TGFα)诱发人肝癌细胞SMMC-7721增生和对Raf-MEK-ERK信号传导的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠, 体重180-200 g, 购自北京实验动物中心. 人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院上海细胞生物所. 二乙基亚硝胺(DEN)购自瑞典Fluca公司. 四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司. RPMI-1640培养基购自GIBCO公司. 小牛血清(FCS)购自杭州四季青公司. TGFα购自Peprotech公司. 考马斯亮兰R-250购自Serva公司. 丙烯酰胺、N, N'-亚甲基叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)购自Gibco公司. 过硫酸胺(APS)、亮抑酞酶(Leupeptin)、NP-40、硝酸纤维素膜购自Sigma公司. 兔抗鼠Raf、MEK、ERK单克隆抗体、Western Blotting Luminol Reagent购自Santa Cruz公司. 细胞总RNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、Amv逆转录酶、随机引物购自Promega公司. GAPDH引物、MEK1引物由上海生工生物公司合成. 全自动酶标仪为奥地利产品. 清肝化瘀方(半枝莲、白花蛇舌草、苦参、三棱、莪术、黄芪等组成)由河北医科大学第四医院制剂室经水煎、浓缩及醇沉制成.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 用含100 mL/L FCS、青霉素100 kU/L、链霉素100 mg/L的RPMI-1640培养液培养人肝癌细胞株SMMC-7721, 置于37 ℃, 50 mL/L CO₂孵育箱中培养, 每3-4 d传代一次, 取对数生长期的细胞用于实验.

1.2.2 中药血清和病理血清的制备[2]: 雄性SD大鼠30只, 随机分为两组: 病理对照组和中药预防组. 每组均给与DEN 35 mg/kg灌胃, 2次/wk, 共16 wk, 中药预防组同时给予成人等效剂量5倍的清肝化瘀方灌胃, 1次/d, 16 wk后两组停用DEN, 中药预防组继续用中药至20 wk. 病理对照组于20 wk末, 中药预防组于最后一次给药后1-2 h下腔静脉取血, 分离血清, 所得血清均经56 ℃, 30 min灭活, 0.22 μm滤器过滤, -70 ℃冻存. 临用前用含10 mL/L FCS的RPMI-1640培养液稀释成100 mL/L浓度.

1.2.3 Western免疫印迹: 细胞生长40 h后弃去培养液, 实验组和对照组分别换成含5 μg/L TGFα的100 mL/L中药血清或5 μg/L TGFα的100 mL/L病理血清的培养液, 培养48 h, 5 g/L胰酶消化, 用预冷的PBS洗涤2次, 加入预冷的细胞裂解液裂解[50 mmol/L pH7.6 Tris-Cl, 150 mmol/L NaCl, 10 mL/L NP-40, 5 mL/L脱氧胆酸, 1 mL/L SDS, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF, 2 mg/L Leuptin], 置0 ℃ 30 mim, 4 ℃ 12000 g离心10 min, 取上清-70 ℃冻存. 采用考马斯亮兰G-250染色法进行蛋白质定量. 在100 mL/L SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离, 半干式电转膜, 封闭后加入MEK-1单抗1:100, 4 ℃过夜, 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗1:1000, 37 ℃ 1 h, 洗膜后ECL显色, 曝光, 洗片进行图像分析, 检测密度扫描值.

1.2.4 细胞总RNA的提取: 将1×10⁹/L细胞10 mL接种于培养瓶, 40 h后, 弃除培养液, 实验组和对照组分别换成含5 μg/L TGFα的100 mL/L中药血清或5 μg/L TGFα的100 mL/L病理血清的培养液, 培养48 h, 一步法进行细胞总RNA的提取.

1.2.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR): 取2 μg总RNA进行逆转录反应, 逆转录产物2 μL进行PCR. MEK1引物设计依据大鼠MEK1序列, 上游引物: 5'-AAGCAACAAAGAGCAAGTC -3', 下游引物: 5'-CAAGCACAAAGCCAATCC -3', 扩增的目的片段长度为212 bp. 大鼠GAPDH扩增的目的片段长度为540 bp. 使用50 μL反应体系, 在相同条件下分别扩增MEK1和GAPDH, PCR的具体循环参数为: 94 ℃ 45 s; 50 ℃ 45 s; 72 ℃ 45 s循环30次; 94 ℃ 45 s; 60 ℃ 45 s; 72 ℃ 5 min末次循环. 循环完成后, 取10 μL PCR产物进行20 g/L琼脂糖电泳、照相、扫描, 用Adobe photoshop图像分析软件进行分析, 计算MEK1/GAPDH的光密度比值及其相对照组的表达量.

统计学处理 所有实验结果采用mean±SD表示, 显著性差异采用t检验.

2 结果

2.1 中药血清对TGFα诱导的肝癌细胞Raf、MEK、ERK蛋白表达的影响

中药血清培养肝癌细胞48 h, 能抑制TGFα对肝癌细胞Ras-Raf-MEK-ERK通路的信号传导, 抑制Raf、MEK、ERK蛋白表达, 其中以抑制MEK表达为主(P<0.05). 结果(表1, 图1).

表1 肝癌细胞Raf、MEK、ERK1, 2蛋白表达(光密度值, mean±SD).

组别	n	Raf	MEK	ERK1, 2
对照组	15	165.9±1.3	255.1±2.4	267.7±1.8
实验组	15	144.5±2.5	172.3±1.9a	236.5±2.1

^aP<0.05.

图1 Western blotting检测SMMC-7721细胞Raf、MEK、ERK蛋白表达. A: 病理组; B: 实验组.

2.2 中药血清对TGFα诱导的肝癌细胞MEK1mRNA表达的影响

RT-PCR检测结果显示, 与对照相比, 中药血清培养肝癌细胞48 h, 能抑制5 μg/L TGFα诱导的SMMC-7721肝癌细胞MEK1mRNA的转录, 密度扫描显示, 其MEK1mRNA的表达相对量较对照组明显减少(P<0.05). 结果(表2, 图2).

表2 肝癌细胞MEK1mRNA表达(光密度比值, mean±SD).

组别	n	MEK1/GAPDH
对照组	15	0.793±0.041
实验组	15	0.598±0.003a

^aP<0.05

图2 RT-PCR检测SMMC-7721细胞MEK1mRNA表达. A: 病理组; B: 实验组.

3 讨论

Ras是质膜胞质面的内在膜蛋白, 而Raf是胞质蛋白, 必须通过Ras-GTP-Raf-1结合才能把Raf转位到质膜骨架蛋白上. Raf定位于胞膜是其活化的前提. Raf的失活主要表现在从膜上回到细胞质中, 与Raf的脱磷酸化有关. 本研究中, 清肝化瘀方含药血清未能明显抑制Raf的蛋白的表达, 可能与清肝化瘀方含药血清未能使Raf磷酸化, 从而未能转移到细胞膜有关.

有研究表明, 在肝癌组织中, 位于信号转导途径上游的Raf-1激酶活性在癌变组织与非癌变组织相似, 但属于其家庭的MEK激酶活性在癌变组织明显升高, 位于信号转导途径下游的MAP激酶活性也明显升高, 可见, 肝细胞癌变后MAP激酶途径发生了变异. 我们的实验也证实了这一点. 肝癌模型组病理血清培养肝癌细胞与中药血清培养细胞对Raf蛋白表达无明显差别, 而MEK蛋白表达明显升高, 表明病理血清培养的肝癌细胞MEK可能发生了变异, MEK1mRNA的RT-PCR实验表明病理血清培养的肝癌细胞MEK1的mRNA表达明显升高, 这与病理血清能够促进MEK1的两个氨基酸位点磷酸化有关. 而清肝化瘀方能够抑制MEK1的mRNA的表达, 这可能与清肝化瘀方含药血清能够促进MEK1的两个氨基酸位点脱磷酸化, 从而能降低MEK1蛋白的表达.

ERK信号转导通路是目前研究最为彻底的MAPK通路[4-10], 他受生长因子刺激而激活后, 移位至细胞核, 引起转录因子的磷酸化, 使得c-fos, c-myc, c-jun等基因的转录水平升高, 导致细胞增生. 免疫荧光显示, ERK位于胞质和胞核, 激活后, 移位至细胞核[11]. 我们也证实了这一点, 病理血清作用细胞后, 胞核着色明显加深, 而清肝化瘀方含药血清作用细胞后, 胞核着色明显减弱[2], 表明清肝化瘀方含药血清能明显减少ERK进入细胞核, 抑制其在细胞核中的表达, 因而能阻断TGFα在肝癌细胞中的信号传导, 抑制TGFα诱导的肝癌细胞增生.

清肝化瘀方能阻断TGFα对肝癌细胞的作用, Western印迹表明, 清肝化瘀方含药血清能抑制Raf、MEK、ERK蛋白的表达, 但以抑制MEK蛋白为主. 其机制可能与阻断TGFα信号传导有关.

备注

编辑: 张海宁

参考文献

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