慢性HBV携带者外周血T细胞亚群的不同年龄变化

摘要

目的: 探明携带者随着年龄增长由免疫耐受期进入免疫激活期的机制.

方法: 慢性HBV携带者104例取外周血检测T细胞亚群与健康对照40例作比较. 分别以5岁、10岁、20岁为间隔将慢性HBV携带者分组, 比较各年龄组之间HBeAg阳性率及T细胞亚群.

结果: 慢性HBV携带者与健康对照比较CD3 (F = 5.976, P = 0.016)、CD4 (F = 46.244, P = 0.0001)、CD4/CD8 (F = 254.357, P = 0.0001)下降, CD8 (F = 103.848, P = 0.0001)升高. 慢性HBV携带者CD8 (F = 6.726, P = 0.011)T细胞30岁后明显下降. 慢性HBV携带者30岁前e抗原阳性组较阴性组CD4 (F = 11.123, P = 0.001)明显降低, 30岁后则无显著差异.

结论: 机体(HLA限制性和CD4 T细胞无应答性)和病毒(HBeAg的免疫耐受调节作用)两方面因素决定了30岁左右为慢性HBV携带者病情及细胞免疫功能转折点.

关键词: HBV; T细胞亚群; 免疫功能

Change in T cell subset of chronic HBV carriers with different ages

Yan-Wei Qiao, Jing You, Lin Zhuang, Hong-Ying Chen, Lan Yu, Hui-Yun Gao, Guo-Bing Wu, Jun-Yan Qv

Yan-Wei Qiao, Jing You, Hong-Ying Chen, Lan Yu, Hui-Yun Gao, Guo-Bing Wu, Jun-Yan Qv, Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Lin Zhuang, Department of Hepatopathy, Third People's Hospital of Kunming, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Supported by: Scientific Research Foundation of Yunnan Education Office, No. 028Y213.

Correspondence to: Dr. Jing You, Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, 295 Xichang Road, Kunming 650032, Yunnan Province, China. jingyoukm@163.com

Received: October 18, 2004
Revised: October 28, 2004
Accepted: November 4, 2004
Published online: January 1, 2005

Abstract

AIM: To investigate the mechanism of the transition from immunological tolerance to immunological activation of chronic hepatitis B virus (HBV) carriers.

METHODS: T cell subsets were examined in chronic HBV carriers (n = 104) and health controls (n = 40). The carriers were divided into different groups at age intervals of 5, 10 and 20 years. The T cell subsets and the positive rate of HBeAg were comparatively analyzed between different groups.

RESULTS: In comparison with those in health controls, the levels of CD3, CD4, and CD4/CD8, in chronic HBV carriers were significantly lower (F = 5.976, P = 0.016, F = 46.244, P = 0.0001, and F = 254.357, P = 0.0001, for CD3, CD4, and CD4/CD8 respectively), but the level of CD8 was higher (F = 103.848, P = 0.0001). The number of CD8, T cells was significantly decreased in chronic carriers over 30 years old (F = 6.726, P = 0.011). Before 30 years old, the CD4 level in HBeAg positive group was lower than that in HBeAg negative group.

CONCLUSION: Human leukocyte antigen restriction and CD4 T cell nonresponsiveness as well as the HBeAg adjustment of immunological tolerance determine that the turning point of the illness state and cell immune function of chronic HBV carriers occurs at the age around 30 years old.

Key Words: HBV; T cell subset; Immune function

0 引言

人体外周T淋巴细胞由不同的亚群组成. T淋巴细胞是宿主抗病毒、抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞, 构成了免疫系统的主要部分, 并由T淋巴细胞各亚群的比例来调节和维持人体免疫内环境的稳定[1]. 一般认为, 各种免疫细胞特别是T细胞亚群之间的调节紊乱, 不论原因来自宿主还是缘于病毒, 是体内不能清除病原体及HBV在肝内持续复制的主要原因. 我国的慢性HBV携带主要是于婴幼儿期感染建立的免疫耐受性, 随着年龄增长耐受性逐渐减弱, 对病毒复制的抑制也逐渐加强, 经漫长的病毒携带后, 大多可以缓慢自发性清除[2]. 实验采用流式细胞仪检测慢性HBV携带者外周血T细胞亚群, 并通过分析不同年龄慢性HBV携带者外周血T细胞各亚群变化的规律, 探明携带者随着年龄增长由免疫耐受期进入免疫激活期的机制.

1 材料和方法

1.1 材料选择

慢性HBV携带者104例, 男62例, 女42例, 年龄 13-50岁. HBsAg阳性, 但无肝炎症状和体证, 各项肝功能检查正常, 经半年观察无变化[3]. 其中HBsAg(＋), HBeAg(＋), HBcAb(＋)59例, HBsAg(＋), HBeAb(＋), HBcAb(＋)41例, HBsAg (＋), HBcAb(＋)4例. 10-20岁18例, 21-30岁52例, 31-40岁24例, 41-50岁10例. 全部患者排除甲、丙、丁、戍型肝炎, 6 mo内无应用免疫制剂史. 健康对照组(Health group)40名. 年龄16-46岁, 均为健康体检合格人员, 无肝病病史及肝病证据. 10-30岁30例, 31-50岁10例.

1.2 方法

取全血(EDTA抗凝)100 μL加三色mAb (CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE由苏州生物基因公司提供) 20 μL, 混匀, 室温放置20 min. 放入Muti-Q-Prep处理仪处理(由美国Coulter公司提供) 后, 用流式细胞仪(Coulter Epics-XL型流式细胞仪)进行检测. 阴性对照取全血100 μL加20 μL小鼠IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE(由苏州生物基因公司提供) 20 μL, 其余步骤同上. 血清乙肝标志物(HbsAg, HbsAb, HbeAg, HbeAb, HbcAb, Anti-HBcAbIgM) 检测用ELISA法, 血清HBV DNA检测用PCR法. 操作严格按试剂盒使用说明进行.

统计学处理 采用SPSS 11.0软件包对各组间检测结果进行方差分析检验.

2 结果

慢性HBV携带者与健康对照比较T细胞亚群不同. 慢性HBV携带者较健康人CD3, CD4, CD4/CD8下降, CD8升高(表1). 以年龄分组慢性HBV携带者T细胞亚群不同. 以5岁, 10岁为间隔分组, T细胞各亚群均未见显著差异. 扩大为以20岁为间隔分组, CD8T细胞30岁后明显下降(表2). 10-30岁和31-50岁组HBeAg(＋)慢性HBV携带者T细胞亚群不同. 慢性HBV携带者30岁前e抗原阳性组较阴性组CD4明显降低, 30岁后则无显著差异(表3).

表1 慢性HBV携带者T细胞亚群.

分组	n	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
ASC	104	67.39±8.99a	32.92±6.64b	34.07±8.48b	1.04±0.36b
Health	40	70.98±3.52	40.32±2.85	20.24±1.91	2.01±0.19

^aP<0.05,

^bP<0.001, vs Health group.

表2 以5、10、20岁为间隔分组慢性HBV携带者T细胞亚群检测结果.

年龄(岁)	n	HBVM	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
11-15	2	1.5±0.70	61.25±10.11	32.05±1.34	28.85±9.26	1.16±0.32
16-20	16	1.06±0.25	68.95±6.83	31.56±7.79	37.32±7	0.89±0.32
21-25	19	1.42±0.50	67.12±8.15	33.2±4.69	34.21±7.63	1.01±0.26
26-30	33	1.39±0.55	69.16±10.08	33.18±7.02	35.82±9.12	1.00±0.37
31-35	14	1.57±0.51	66.2±8.03	33.55±6.08	31.71±6.67	1.10±0.30
36-40	10	1.70±0.67	62.1±4.24	31.5±7.63	28.7±8.15	1.18±0.52
41-45	5	2.20±0.44	63.3±10.4	35.8±6.24	26.94±5.26	1.36±0.44
46-50	5	1.8±0.83	71.8±15.51	32.92±8.29	38.02±11.08	0.94±0.35
10-20	18	1.11±0.32	68.10±7.30	31.62±7.33	36.38±7.47	0.92±0.32
21-30	52	1.40±0.53	68.41±9.39	33.19±6.22	35.32±8.56	1.01±0.33
31-40	24	1.62±0.57	64.56±6.91	32.69±6.69	30.45±7.31	1.13±0.39
41-50	10	2.00±0.66	67.58±13.22	34.36±7.94	32.48±10.45	1.15±0.44
10-30	70	1.32±0.50b	68.33±8.85c	32.79±6.5c	35.53±8.26a	0.98±0.33a
31-50	34	1.73±0.61	65.45±9.11	33.18±7.00	31.05±8.24	1.14±0.40
健10-30	30		70.90±3.49	40.19±2.58	20.31±2.10	1.99±0.18
康31-50	10		71.21±3.81	40.71±3.67	20.00±1.22	2.04±0.24

^aP<0.05,

^bP<0.001,

^cP>0.05 vs 31-50岁组.

表3 <30和>30岁HBeAg (+)慢性HBV携带者T细胞亚群.

分组	n	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
<30
大三阳	48	68.83±8.99a	31.15±6.03b	37.73±8.07b	0.878±0.29b
小三阳	22	67.24±8.64	36.36±6.17	30.71±6.55	1.22±0.28
>30
大三阳	12	68.54±9.68a	30.4±6.28a	36.54±9.64b	0.89±0.32b
小三阳	22	63.76±8.53	34.7±7.04	28.05±5.61	1.28±0.38

^aP>0.05,

^bP<0.01 vs 小三阳组.

3 讨论

HBV不能从人体内清除就形成HBV感染慢性化, 慢性化可表现为HBV慢性携带者, 也可表现为慢性肝炎. 对HBV呈完全免疫耐受则表现为慢性携带者, 对HBV免疫功能低下, 即对HBV抗原有一定识别和清除能力, 从而导致一定的肝细胞损害, 则表现为慢性肝炎. 慢性HBV携带与慢性肝炎的区别, 主要是病情发展极为缓慢, 活动性极为微弱.

慢性HBV携带者与健康对照比较CD4, CD4/CD8下降, CD8升高[4-9]. 而CD3的检测结果各不相同, 如有研究发现CD3较健康对照降低[8]、高[6], 或正常组比较无显著差异. 本研究支持CD3较健康对照降低的结论, 检测结果的差异应与病例选择和检测方法的不同有关. 有研究指出新生儿感染90%, 小儿感染20-40%, 成人感染5-10%为慢性携带[10], 而HBeAg(+)携带者母亲的新生儿形成慢性感染的危险性最大. 提示HBeAg在这一过程中起关键作用. 首先, HBeAg起耐受原的作用. 起始于宫内的HBeAg特异T细胞耐性, 偏向Th2亚型, 在HBV垂直传播中消耗Th1细胞, 从而形成Th2对Th1细胞的优势性. 这种优势性进一步抑制机体的细胞免疫功能, 导致病毒不能被机体清除, 形成出生后的慢性感染. 30岁左右为慢性HBV携带者病情及细胞免疫功能转折点, 慢性HBV携带者CD8T细胞30岁后明显下降. 骆抗先et al研究发现83例病毒高复制的慢性HBV携带者年龄中位数为25岁, 而45例免疫活动的携带者年龄中位数为31岁, 133例活动应答后感染低落携带者年龄中位数为32岁. 而且慢性HBV携带者在30岁前HBeAg阳性率23-34%, 感染状态较稳定; 30岁以后HBeAg阴性率较高, 且逐年升高. 据此推测30岁左右为慢性HBV携带者病情转折点. 本实验先以5岁为间隔分组, 各组之间T细胞各亚群均未见显著差异. 再合并相邻两组, 扩大为以10岁为间隔分组, 各组之间T细胞各亚群仍未见显著差异. 提示以5岁直至以10岁为间隔分组时各个年龄段之间细胞免疫功能变化不大. 当再次合并相邻两组、扩大为以20岁为间隔分组, 即将全部患者分为30岁前后两组时, 发现慢性HBV携带者CD8T细胞30岁后明显下降, 且30岁后HBVM(相当于HBeAg阴性率)显著升高. 而健康人20-50岁之间包括T细胞亚群在内的主要免疫指标相对恒定, 没有明显变化[11]. 本实验中40名健康对照同样以20岁为间隔分为30岁前后两组, CD3, CD4, CD8等T细胞各亚群均未见显著差异, 证明30岁后CD8T细胞明显下降为慢性HBV携带者特有表现. 提示30岁左右为慢性HBV携带者病情及细胞免疫功能转折点.

慢性HBV携带者30岁前CD8T细胞(主要是Tc细胞)克隆增生、较健康对照升高, 但未能清除病毒控制感染, 其原因可能为: (1)Tc细胞克隆不充分, 不足以杀灭全部病毒. (2)Tc细胞受病毒和机体内其他因素(如HLA限制性)制约, 自身功能低下, 不能有效杀灭病毒. 本研究中, 慢性HBV携带者30岁后病毒清除、病情好转, 但未发现Tc有先克隆增值、比例升高, 清除病毒后再下降的现象, 而是直接下降. 提示慢性HBV携带者30岁前病毒未能有效清除与Tc细胞克隆不充分关系不大, 其主要原因应为Tc细胞受内外因素影响, 自身细胞免疫功能低下. 这些因素包括病毒和机体两个方面. 病毒方面主要为HBeAg的免疫耐受调节作用. 肝细胞膜表达的HBcAg是CTL识别和攻击的主要靶抗原, 而CTL在免疫识别上并不能区分HBeAg和HBcAg, 在血液中HBeAg与HBe/cAg特异性CTL结合, 通过启动Fas途径诱导CTL凋亡, 缓和CTL对感染肝细胞的免疫攻击. 而且HBeAg能够干扰HBcAg的装配, 从而影响HBcAg在肝细胞膜上的正常表达. 所以HBeAg是干扰CTL免疫识别和造成免疫耐受的主要因素[12]. 机体方面包括HLA限制性和CD4T细胞无应答性等因素.

慢性HBV携带者30岁前e抗原阳性组较阴性组CD4明显降低, 30岁后则无显著差异. HBeAg致敏的Th细胞高效产生IL-4和较低量的IFN-γ, 而HBcAg免疫高效诱导IL-2、IFNγ和低水平的IL-4. HBeAg优势诱导Th2样细胞, HBcAg优势诱导Th1样细胞. HBeAg诱导的Th2对Th1细胞优势性导致CD4(主要是Th1细胞)下降. 所以30岁前慢性HBV携带者e抗原阳性组较阴性组CD4明显降低主要原因应为HBeAg的免疫耐受调节作用. 而30岁后在宿主长期免疫压力下HBV病毒发生基因组前C区变异, e抗原阳性组患者多混合感染变异株与野生株, 而且随着病程的增长, 变异株在感染毒株群体中的比例逐步增加. 由于变异株不能合成HBeAg, 变异株在感染毒株群体中比例的增加无疑会减弱HBV合成HBeAg的能力, 从而减弱HBeAg的免疫耐受调节作用. 所以30岁后e抗原阳性和阴性组CD4T细胞没有同30岁前一样前者明显低于后者, 而是二者之间无显著差异.

备注

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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