修回日期: 2004-10-20
接受日期: 2004-10-27
在线出版日期: 2005-01-01
目的: 探测河南食管贲门癌高发区居民贲门癌及其淋巴结转移灶中染色体基因组的变化特征, 为进一步筛选与贲门癌变和淋巴结转移相关基因提供理论依据和范围.
方法: 应用比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization, CGH)来分析原发性贲门癌患者30例及其相应淋巴结转移灶7例中染色体基因组的变化.
结果: 在贲门癌30个样本中总共有126增加和117丢失; 每例患者平均DNA拷贝数的增加和丢失分别为4.2和3.9. 染色体基因组增加频率最高的是20q (43%), 其次为6q (40%), 8q (37%), 7p (27%), 6p (33%), 7q (33%), 1q (30%), 13q (23%), 11q (20%)和5p (20%). 染色体基因组丢失频率最高的是17p (57%), 其他为19q (50%), 1p (47%), 3p (30%)和4p (20%). 在贲门癌淋巴结转移灶7例中, 总共有75增加和58个丢失, 平均DNA拷贝数的增加和丢失分别为10.7和8.3. 染色体增加为8q (5/7), 20 (4/7)和1q, 2p, 3q, 6, 7, 11p11-q13, 11q14-q23, 13 (均为3/7), 染色体的丢失为9p13-qter (4/7), 4 (3/7) 和1pter-1q33, 7p12-qter, 16p, 17p, 18 (均为2/7).
结论: 20q, 6q, 8q, 7p, 6p, 7q, 1q, 13q, 11q, 5p的染色体基因组增加和17p, 19q, 1p, 3p, 4p的丢失与贲门癌相关, 而8q, 20的增加和9p13-qter, 4 pq的丢失可能与贲门癌的淋巴结转移相关.
引文著录: 秦艳茹, 王立东, 邝丽芸, 关新元, 庄则豪. 比较基因组杂交技术: 贲门癌和淋巴结转移灶的染色体变化特征. 世界华人消化杂志 2005; 13(1): 15-19
Revised: October 20, 2004
Accepted: October 27, 2004
Published online: January 1, 2005
AIM: To profile the chromosomal imbalances in gastric cardia adenocarcinoma (GCA) and the metastatic lymph node (LN) lesions from the high incidence area of esophageal squamous cell carcinoma/GCA in He'nan province, and to provide the molecular basis for identifying the related genes for GCA and GCA lymph nodes metastasis.
METHODS: Chromosomal imbalances were studied in 30 GCA resection specimens and 7 metastatic LN lesions by comparative genomic hybridization (CGH).
RESULTS: In 30 GCA specimens, a total of 126 gains and 117 losses were found, and the average gain and loss was 4.2 and 3.9, respectively. The chromosomal gain most frequently identified in GCA was on 20q (43%), and others were on 6q (40%), 8q (37%), 6p (33%), 7q (33%), 1q (30%), 7p (27%), 13q (23%), 11q (20%) and 5p (20%) respectively. Losses were observed predominantly on 17p (57%), 19q (50%), 1p (47%), 3p (30%) and 4p (20%). In 7 LN lesions, a total of 75 gains and 58 losses were found, and the average gain and loss were 10.7 and 8.3, respectively. Gains were detected on chromosome 8q (5/7), 20 (4/7) and 1q, 2p, 3q, 6, 7, 11p11-q13, 11q14-q23, 13 (3/7 each), and deletions on chromosome 9p13-qter (4/7), 4 (3/7) and 1pter-1q33, 7p12-qter, 16p, 17p, 18 (2/7 each).
CONCLUSION: The gains of 20q, 6q, 8q, 7p, 6p, 7q, 1q, 13q, 11q, 5p and losses of 17p, 19q, 1p, 3p, 4p are specifically implicated in GCA, and gains of 8q, 20q and losses of 9p, 4pq may be associated with lymph node metastasis.
- Citation: Qin YR, Wang LD, Kwong D, Guan XY, Zhuang ZH. Comparative genomic hybridization for the profile of chromosomal imbalances in cardia adenocarcinoma and metastatic lymph node lesions. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005; 13(1): 15-19
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v13/i1/15.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v13.i1.15
贲门癌是中国北方地区最常见的恶性肿瘤之一, 其显著的流行病学特征是与食管癌流行地域一致性. 河南省林州市及其毗邻的安阳, 辉县等地是中国, 也是世界食管癌和贲门癌发病率和死亡率最高的地区. 但是贲门癌的分子发病机制尚不清楚. 近年的研究提示, 人类肿瘤的发生是一个包含多种遗传变化的过程, 其中一项重要的变化是肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活[1]. 应用先进的分子细胞遗传学技术寻找肿瘤中相关基因的变化, 是当前人类恶性肿瘤研究的重要领域, 对揭示肿瘤发生发展机制具有重要的意义. 作者采用比较基因组杂交技术[2], 分析了30例原发性贲门癌组织的DNA样品7例相应转移淋巴结组织的DNA样品, 所获结果为克隆该地区贲门癌发生的相关基因提供了重要依据.
河南林州市姚村医院2001/2002年贲门癌患者手术切除原发性贲门癌癌组织30例(男23例, 女7例, 年龄40-74)和对应的淋巴结转移灶7例迅速放入液氮后储存于-80 ℃冰箱中备用. 所有患者术前均未进行过放化疗. 病理学检查证实均为贲门腺癌, 淋巴结为贲门腺癌淋巴结转移, 组织和细胞形态与原发灶相似.
对癌组织和转移的淋巴结进行冰冻切片, 950 mL/L乙醇固定, 在解剖显微镜下刮片, 分离出癌细胞. 应用蛋白酶K/SDS消化, 酚/氯仿/异丙醇抽提DNA. 正常参照组DNA来自正常胎盘. 常规抽取健康男性静脉血5 mL, 每1 mL加入RPMI1640培养基(FBS)50 mL, PHA 120 μL(48 μg)进行外周血培养(50 mL/LCO2培养箱孵育72 h), 培养终止前30 min加入秋水仙素50 μL (0.5 μg), 用75 mmol/L KCl低渗液处理20 min, 使细胞分裂停留在中期, 甲醇-冰醋酸(3:1)固定, 制成细胞悬液, 滴片, 自然干燥, 37 ℃孵育3-7 d备用.
1.2.1 DNA探针的制备切口平移法标记DNA探针: 肿瘤组织DNA1 μg和正常参照组DNA 1 μg分别用Spectrum-Green-dUTP (Vysis, Downers Grove)和Spectrum Red-dUTP (Vysis, Downers Grove)标记. 15 ℃反应2 h, 凝胶电泳核对DNA片段的长在200-2000 bp, 以产生均匀一致的, 强烈的杂交信号. 标记好的DNA探针用乙醇沉淀纯化.
1.2.2 比较基因组杂交: 标记好的肿瘤基因组DNA探针和正常参照组探针和Cot-1DNA溶于杂交缓冲液10 μL中(500 mL/L甲胺, 2×SC, pH7.0)75 ℃变性5 min. 制备好的中期分裂像玻片, RNase处理, 70%甲酰胺变性液75 ℃, 变性5 min, 2×SSC各5 min. 杂交混合液滴于玻片上, 湿盒内37 ℃孵育3 d. 杂交后玻片用0.4×SC/0.3%NP40洗液75 ℃洗片2 min, 然后用2×SSC/0.1%NP40室温下洗片2 min, 洗片后DAPI 40 μL进行染色. 应用装有Sensys相机的Zeiss Axioplan 2显微镜对杂交的中期染色体进行数字化图像分析. 应用Quips CGH程序(Vysis, Downers Grove, IL)进行图像分析, 每例应用5个中期相细胞产生的荧光比率进行综合分析. DNA序列拷贝数扩增和丢失的分析阈值分别为肿瘤/正常参照比率>1.25或<0.75, 高拷贝数的扩增为肿瘤/正常参照比率>1.50.
统计学处理 利用χ2检验Fisher精确概率法. P<0.05有统计学意义.
分析30例原发性贲门癌标本均有染色体的异常(图1, 表1). 在贲门癌30各样本中总共有126增加和117丢失; 每个患者平均DNA拷贝数的增加和丢失分别为4.2和3.9. 贲门癌组织发生DNA拷贝数增加的染色体分布特征是: 染色体20q发生DNA拷贝数增加的频率最高(13/30, 43%), 依次还有6q (12/30, 40%), 8q (11/30, 37%), 6p (10/30, 33%), 7q (10/30, 33%), 1q (9/30, 30%), 3q (9/30, 30%), 7p (8/30, 27%), 16q (8/30, 27%), 13q (7/30, 23%), 5p (6/30, 20%)和11q (6/30, 20%). 最小重叠区域常常发生在20q12-qter, 8q23-24.1, 6p12-6q13, 7q21, 1q21-23, 3q23-24和16q11-23. 有17例DNA高拷贝数的扩增, 他们分别发生在染色体1p13-1q23, 3q24-26, 5p, 6p12-6q14, 8p22-qter, 9p12-q21, 10q22-qter, 11q14-11q23, 12p12-12q11, 12q13-23, 16p11-13和20q. 贲门癌组织发生DNA丢失的染色体分布特征是: 染色体17p发生DNA丢失的频率最高(17/30, 57%), 依次还有19p (15/30, 50%), 1p (14/30, 47%), 4p (6/30, 20%).
| Case Number | Gains | Losses |
| 57 | 6p21-6q13, 16p11-16q21, 20 | 1pter-1p31, 17, 19 |
| 195 | 4, 5p, 7pter-7q31, 8q11-8q23, 13 | 1pter-1p31, 1p13-1q21, 9q, 14, 15, 17pter-17q21, 19, 22 |
| 216 | 1q, 5p, 6p, 7, 8q, 16p11-16q21, 20 | 1pter-1p22.3, 4, 19, 21 |
| 236 | 5p14-5q32, 6q13-6q24, 7q21-31 | 1pter-1p33, 6p, 17p, 19, 22 |
| 01-637 | 5p, 6, 7pter-7q31, 8q, 20 | 1pter-1p22, 8p, 12q21-12qter, 16 |
| 16176 | 3q, 6p21-6qter, 8q, 10p, 11q11-q23.3, 11q14-11q23, 14 | 4q, 9p12-9pter, 13, Y |
| L16176 | 1q, 3q, 6, 7, 8, 11p11-11q23, 11q14-11q23, 14 | 3p, 4, 9p13-9qter, 13 |
| 16178 | 5, 12pter-12q23, 12p12-11, 12q13-12q23 16p11-16q13, 20 | 6p, 9q, 19 |
| 16607 | 8q12-8qter | 1pter-31, 17, 19 |
| 16661 | 1p13-1q23, 6q13-6qter, 8q, 11p, 11q13-11qter, 13, 18q12-18qter, 20p12-20qter | 4p, 5p, 8p, 12pter-12q13, 16p, 17p |
| L16661 | 1p13-1qter, 1p13-1q21, 5p, 6p12-6q15, 8q, 10p11-10q21, 11pter-11p12, 11q13-11qter, 13, 18, 20 | 4, 7p12-7qter, 8p, 9, 12q22-12qter, 16p, 17p |
| 16689 | 1q12-1q31, 18p | 4, 6p, 17, 19 |
| 16699 | 20 | 19p |
| 16736 | 6p21-6qter, 8p, 12q14-12q21, 18 | 1pter-1p32, 3p, 14, 16, 17, 19, 22 |
| 16737 | 1p13-1q23, 6p22-6q13, 7, 9p13-9q22, 9p12-9q21, 10pter-10q25, 15 | 1pter-1p21, Y |
| 16717 | 2q31-2q33, 3q24-3qter, 4p12-4q13, 7, 8q, 11p14-11p11 | 1pter-1p31, 5q, 13, 14, 17, 19 |
| 16724 | 2pter-2p21, 3q23-3q26, 5p14-5q12, 7, 8 | 1pter-1p31, 17p, 19p, 21, 22 |
| 16726 | 1q21-31, 3q24-3q26, 7q11-7q33, 8, 9, 20 | 1pter-1p31, 2, 3p, 4, 6pter-6q14, 10q, 18, Y |
| L16726 | 2pter-2p22, 4p12-4q13, 16p11-16q21, 20 | 1pter-1p31, 18 |
| 16749 | 2p16-2q33, 3, 7p, 8p11-8qter, 12pter-12q13, 13, 20q | 1pter-1p33, 16, 17, 18, 19p, 21 |
| L16749 | 2p16-2q33, 3p13-3qter, 7, 8q, 12p, 13, 20q12-20qter | 1pter-1p33, 11p12-11q14, 12q21-12qter, 16, 17pter-17q12, 18, 19p, 21, 22 |
| 16777 | 10, 15pter-15q15, 16p12-16q21, 20 | |
| L16777 | 1q32-1qter, 3, 8pter-8q23, 10, 11pter-11q13, 15pter-15q15, 20, 20q12-qter | 9p12-9qter, 11q21-11qter, 17p11-17qter |
| 16791 | 3p12-3qter, 3q24-3q26 | 19 |
| 19114 | 1q22-1qter, 3, 6, 7, 11q23-11qter, 12qter-12q12, 13, 16p | 1pter-1p33, 2q14-2qter, 16q, 17, 19, X |
| 16348 | 6p12-6q14, 13 | 17 |
| 19146 | 3q, 9q22-9qter, 15, 18, 20 | |
| 19419 | 2q14-2qter, 3q21-24, 5p, 6q, 8pter-8p12, 10, 11q13-11q14, 12, 13, 20 | 3p21-3p11, 11p12-11q12, 16, 17 |
| 21113 | 7q21-33 | 3pter-3p24, 6pter-6p22, 7q34-7qter |
| 21116 | 16p11-16q13 | 5pter-5p14, 6p, 6q23-6qter |
| L21116 | 16p11-16q21 | 6p, 14, 16q22-16qter |
| 21127 | 6p21-6q13, 12p12-12q13 | |
| 21143 | 8p22-8qter, 10q22-10qter, 13, 16p11-16q21, 17p11-17qter, 20 | 1p, 2pter-2p14, 3p, 4p, 5q14-5q31, 9pter-9q21, 17p, 21 |
| 21158 | 4q26-4qter, 9p12-9qter | |
| 21159 | 1p13-1q21, 16p11-16q13 | 1pter-1p32, 6q, 9p, 10p, 12q, 14, 17, X |
| 21163 | 1p11-1q22, 5pter-5q12, 6p12-6q13, 16p11-16q13, 18, 20pter-20q11 | 4, 5q, 8p, 17, 18q, 19 |
| 21184 | 1p31-1q31 | 11q |
| L21184 | 6p, 7pter-7q31, 8p12-8qter, 13, 17p | 4, 5pter-5p14, 7q32-7qter, 9p |
在7例贲门癌淋巴结转移灶中, 总共有75增加和58个丢失, 平均DNA拷贝数的增加和丢失分别为10.7和8.3. 其中染色体增加为8q(5/7), 20(4/7)和1q, 2p, 3q, 6, 7, 11p11-q13, 11q14-q23, 13(均为3/7), 染色体的丢失为9p13-qter(4/7), 4(3/7)和1pter-1q33, 7p12-qter, 16p, 17p, 18 (均为2/7).
我们对30例贲门癌患者进行了整个染色体基因组分析, 并且有7例分析了淋巴结转移灶的整个基因组的变化. 通过CGH技术, 不同的报道贲门癌有相似的染色体增加和丢失的形式. 最常见的染色体增加是染色体1q, 3q, 5p, 6p, 7pq, 8q, 12q, 13q, 15q, 17q 18p, 20q, Xpq, 最常见的丢失是染色体4pq, 5q, 9p, 14q, 16q, 17p, 18q, 21q, Y[3-4]. 本实验中染色体的改变与以前的报道大部分一致, 但是我们也探测出一些新的侯选基因区. 本次实验结果显示20q, 6q, 8q, 6p, 7q, 1q, 3q, 7p, 16q, 13q, 5p和11q的染色体基因组增加和17p, 19p, 1p, 4p染色体基因组的丢失频繁(>20%), 最常见的染色体增加是20, 尤其是20q (43%), 有6例呈现20q高拷贝数的扩增, 这和Varis et al[5] 和Van Dekken et al[3]的结果相似. 定位于20q13.2的CYP24, 是公认的原癌基因[6], 而在贲门癌中作用需要进一步研究. 贲门癌中6p和6q的增加率分别为38%和40%, 其最小重叠区在6p12-6q14, 有1例DNA 高拷贝数的扩增. 贲门癌有频发的6p的增加[7], CCND3基因位于6p12-6q14, 他和CCND1基因有53.1%同源性, CCND3基因扩增也许是贲门癌的发病机制之一. 本实验, 7号染色体和8q的增加频繁, Vissers et al[4]对Barrett腺癌和贲门癌CGH结果表明, 位于染色体7和8上EGFR, HGF, MET, CTSB, MYC基因过扩增参与了Barrett腺癌和贲门癌的发病, 7号染色体和8q增加可能在高发区贲门癌发病中起重要作用. 本实验中, 最常见的染色体的丢失是17p (57%). 位于17p的TP53基因控制的P53蛋白可以调节细胞增生和恶性转化. 人类的多种肿瘤有TP53的失活其中包括贲门癌[5]. 19 (50%)号染色体的丢失频繁, 这种情况也见其他肿瘤如食管癌[8]. 但是19号染色体上没有定位抑癌基因. 这个结果提示可能有一个或多个抑癌基因位于19号染色体, 并且与贲门癌相关. 本次实验中1p36的丢失频繁, 这种现象见于多种肿瘤包括贲门癌[5]. 贲门癌中有4号染色体频繁丢失. 最近在4p上定位了ACTN4基因, 他编码非肌肉型α-肌动蛋白, 可以抑制成神经细胞瘤的形成[9], 但他在贲门癌中的作用还不清楚. 4q的丢失可以发生在贲门癌的早期阶段, 并且与贲门癌的进程相关[3].
在大多数样本中原发灶和转移灶的染色体基因组变化大致相同, 但是有增加的染色体改变, 这些染色体的改变可能与转移相关, 如本实验中8q (5/7), 20(4/7), 1q, 2p, 3q, 6, 7, 11p11-q13, 11q14-q23, 13(3/7每例)的增加和9p13-qter(4/7), 4(3/7), 1pter-1q33, 7p12-qter, 16p, 17p, 18(2/7每例) 的丢失. 但是在某些病例, 染色体基因组的增加和丢失, 如16726, 3p, 8q的增加和3p的丢失, 仅仅出现在贲门癌的原发灶中, 而在转移灶没有变化(表2). 一个肿瘤是有多种细胞亚群组成, 各亚群中染色体基因组改变不同, 一个亚群的一种基因组变化有利于克隆选择. 这个亚群在肿瘤中可以是显性亚群, 通过CGH技术, 可以探测到他的基因组改变, 而一些非显性亚群, 探测不到他的基因组改变, 与贲门癌转移相关的染色体基因组改变可以发生在显性亚群和非显性亚群. 因而在本实验中某些染色体的改变只出现在原发灶, 在转移灶中没有此种染色体的改变. 本研究病例数较少, 需要扩大病例.
| Chromosome Number | Gain site | Rate | Loss site | Rate |
| 1 | 1q+ | 9/30(30%) | 1p- | 14/30(47%) |
| 3 | 3q+ | 5/30(17%) | 3p- | 9/30(30%) |
| 4 | 4p- | 6/30(20%) | ||
| 5 | 5p+ | 6/30(20%) | 5q- | 3/30(10%) |
| 6 | 6q+ | 12/30(40%) | ||
| 7 | 7p+ | 10/30(33%) | ||
| 8 | 8q+ | 11/30(37%) | 8p- | 3/30(10%) |
| 9 | 9q- | 5/30(17%) | ||
| 12 | 12p+ | 5/30(17%) | ||
| 13 | 13q+ | 7/30(23%) | 13q- | 2/30(7%) |
| 17 | 17p- | 17/30(57%) | ||
| 18 | 18q+ | 4/30(13%) | ||
| 18 | 18p+ | 4/30(13%) | ||
| 19 | 19p- | 15/30(50%) | ||
| 20 | 20q+ | 13/30(43%) |
这些结果提示20q, 6q, 8q, 7p, 6p, 7q, 1q, 13q, 11q, 5p的染色体基因组增加和17p, 19, 1p, 3p, 4的丢失与贲门癌相关, 在这些染色体上可能存在与贲门癌相关基因, 而8q, 20的增加和9p13-qter, 4的丢失可能与贲门癌的淋巴结转移相关, 同时本实验为应用CGH技术来探测原发性肿瘤极其对应的转移灶的染色体基因组的异常提供了一个模型.
编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁
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