拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒逆转录酶基因变异分析

摘要

目的: 了解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV逆转录酶基因变异之间的关系.

方法: 采用PCR产物直接测序方法对3例病毒核酸无应答患者体内HBV RT区基因序列治疗前后的变异情况进行分析.

结果: 治疗前后6份标本核苷酸变异率为0.63%-1.52%, 氨基酸变异率为0.38%-1.90%, 其中出现rtY203H、rtS256C、rtL269I变异的频率较高, 此外尚有1例出现rtL180M变异.

结论: 拉米夫定治疗中病毒核酸无应答可能与HBV RT区基因变异有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: September 29, 2004
Revised: October 4, 2004
Accepted: October 11, 2004
Published online: January 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

拉米夫定是目前主流抗乙型肝炎病毒(HBV)药物之一, 在短期内可使HBV DNA水平下降, 但仍有部分患者出现病毒核酸无应答[1]. 为了解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV逆转录酶(reverse transcriptase, RT)基因变异有无关系, 我们采用PCR产物直接测序方法对病毒核酸无应答患者体内HBV RT区基因序列治疗前后的变异情况进行分析.

1 材料和方法

1.1 材料

自北京地坛医院就诊的慢性HBV感染者中选取3例经拉米夫定治疗12 mo血清DNA始终阳性者作为研究对象; 分别采集治疗前及治疗12 mo血清, 于-70 ℃保存备用. 3例患者均为男性, 年龄19-51岁, 临床诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准[2]; 治疗方法为拉米夫定(贺普丁, 由英国葛兰素公司生产)100 mg, 每日1次; 每2 mo随访1次, 检测肝功能、HBV DNA及HBVM(表1).

表1 三例患者拉米夫定治疗前后临床资料.

病例号	年龄(岁)	治疗前					治疗12 mo后
		ALT(IU/L)	Tbil(mmol/L)	HBeAg	Anti-HBe	HBV DNA(copies/L)	ALT(IU/L)	Tbil(mmol/L)	HBeAg	Anti-HBe	HBV DNA(copies/L)
216	20	108	20	+	-	3.6×1010	33	20	+	-	8.1×109
393	51	65	14	+	-	8.1×1011	26	42	+	-	3.4×109
506	19	62	12	+	-	2.3×1012	46	18	+	-	2.9×1010

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取: 采用异硫氰酸胍一步法提取血清中的DNA. 待检血清50 μL加入含4 mol/L异硫氰酸胍的裂解液60 μL, 37 ℃温育10 min; 加入酚: 氯仿: 异戊醇(25:24:1)50 μL, 震荡混匀后13000 g离心10 min; 取上清, 加入等量异丙醇, -20 ℃沉淀2 h, 13000 g离心10 min, 弃上清; 加入600 mL/L乙醇50 μL, 13000 g离心10 min, 弃上清, 室温干燥后加入20 μL双蒸水溶解, -20 ℃保存.

1.2.2 HBV基因型检测: 采用巢式PCR技术进行HBV基因型检测, 具体方法见参考文献[3].

1.2.3 HBV RT区基因测序: (1)巢式PCR引物设计: 检索GenBank收录的HBV基因全序, 采用Primer Premier5.0及Oli go 6.67软件辅助分析, 于HBV RT区内设计巢式PCR引物, 其中外引物: P1:5'-CCTCACCCATATCGTCAA-3'(nt105-122), P2:5'-GAGCCACAAAGGTTCCAC-3'(nt1255-1238); 内引物: P3:5'-GCACCGAACATGGAGAAC-3'(nt146-163), P4:5'-AGGCAGGATAGCCACATT-3'(nt1051-1034)(引物由上海生工生物技术公司合成). (2)巢式PCR反应: 30 μLPCR反应体系含TaKaRa Ex Taq^TM DNA聚合酶(购自大连宝生物工程有限公司)1U、10×扩增缓冲液3 μL、25 mol/L dNTP 0.12 μL、50 μmo l/L引物0.12 μL; 第一轮PCR模板为血清抽提物6 μL, 引物为P1、P2; 第二轮PCR模板为第一轮PCR产物3 μL, 引物为P3、P4. 两轮PCR循环温度条件均为94 ℃ 3 min, 94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s, 共30循环, 72 ℃ 7 min. 取第二轮PCR产物8 μL, 以10 g/L琼脂糖凝胶电泳, EB染色后, 于紫外灯下观察结果, 于906 bp处出现荧光条带者为阳性. (3)PCR产物测序: 将第二轮PCR产物经10 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后, 分别以P3、P4为测序引物, 应用双脱氧末端终止法进行序列测定(由北京鼎国生物技术公司完成). (4)序列分析: 基因型检测结果显示各标本均为C型, 故选取GenBank中收录的HBV C型基因序列50条(均与拉米夫定治疗无关), 生成共享序列(consensus); 并从中随机选取6条(AB014378、AF223960、AF068756、D23683、AB014389、AF458664)与6份标本测序结果一同进行核苷酸序列及氨基酸序列分析. 序列分析应用DNAstar、clustalx、GeneDoc等分子生物学软件完成.

2 结果

2.1 巢式PCR产物电泳结果

阳性标本PCR产物大小与预期值相符, 为906 bp(图1).

图1 PCR产物电泳结果. P: 阳性标本; N: 空白对照; M: DGL2000 DNA Marker.

2.2 HBV RT区测序结果

3例患者治疗前及治疗12 mo时共6份标本均成功测序, 有效序列长度为786 bp(nt217-1002). 测序结果已提交至GenBank, 其序列号(accession number)分别为: AY762897, AY762898, AY762899, AY762900, AY762901, AY762902.

2.3 HBV RT区序列分析

6份标本核苷酸变异率为0.63%-1.52%, 氨基酸变异率为0.38%-1.90%, 较既往GenBank中收录的HBV C型基因序列的变异率无明显差别(1.01%-2.67%, 0.76%-3.43%)(表2). 但进一步分析拉米夫定治疗前后HBV RT区氨基酸变异情况发现: 变异集中在逆转录酶第269, 256, 203氨基酸位点上, 此外尚有一例出现rtL180M变异(表3).

表2 各序列与concensus间的变异率.

	核苷酸序列(%)	氨基酸序列(%)
AB014378	1.65	1.52
AF223960	2.67	3.43
AF068756	1.65	0.76
D23683	1.39	1.14
AB014389	1.52	2.67
AF458664	1.01	1.52
2162	1.27	1.14
2161	0.76	0.76
3932	1.27	2.29
3931	0.63	0.76
5062	0.89	0.38
5061	1.52	1.90

¹拉米夫定治疗12 mo后;

²拉米夫定治疗前.

表3 经拉米夫定治疗12 mo后HBV RT区氨基酸变异情况.

病例号	氨基酸位置	核苷酸变异	氨基酸变异
216	30	GTT→TTT	V→F
	269	ATC→CTC	I→L
393	37	AGC→ACC	S→T
	180	CTG→ATG	L→M
	189	TTA→TCA	L→S
	203	CAT→TAT	H→Y
	256	T GT→AGT	C→S
	269	ATC→CTC	I→L
506	164	CTG→ATG	L→M
	203	TAT→CAT	Y→H
	256	AGT→TGT	S→C
	269	CTC→ATC	L→I

3 讨论

作为有效的抗HBV药物, 拉米夫定治疗12 mo时的HBV DNA阴转率约为80%[4], 仍有部分患者表现为病毒核酸无应答[1]. 既往研究多聚焦在拉米夫定耐药与HBV P区变异间的关系, 鲜有关于拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒基因变异状况的报道. 但曾有研究揭示HBV C区基因变异可能与干扰素治疗无应答有关[5], HBV P区V555I变异多出现在泛昔洛韦初治无应答患者体内[6]. 为解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV RT区变异有无关系, 本研究采用PCR产物直接测序方法对病毒核酸无应答患者体内HBV RT区基因序列治疗前后的变异情况进行了分析. 除检测到rtL180M这一常见拉米夫定耐药变异外, 尚发现病毒核酸无应答患者体内HBV RT区出现rtY203H、rtS256C、rtL269I变异的频率较高. 进一步检索GenBank发现rtL269I在以往发表序列中亦较多见, 说明该位点保守性较差, 可能对逆转录酶活性影响不大; 但未检索到其他位点变异. 上述变异位点均在HBV逆转录酶活性区域内, 也是拉米夫定抑制HBV复制的关键部位, 因此有必要进行体外实验研究, 以进一步明确上述变异对拉米夫定的药代动力学和药效学的影响. 再者, 本研究样本量较小且PCR产物直接测序花费较大, 故尚应设计更为经济、有效的检测方法以进行大样本研究, 进一步明确与病毒核酸无应答相关的关键变异位点.

HBV存在准种状态, 随机克隆测序不适于研究抗病毒治疗前后的病毒基因序列变化, 应从准种中的优势种群的变异情况来阐明HBV基因的变化与临床病情间的相互关系[7]. 故本研究采用PCR产物直接测序方法进行拉米夫定治疗前后HBV RT区基因序列变异分析. 该方法所获得的测序结果可代表患者体内某时点的HBV优势株, 故而具备治疗前后的可比性. 为保证测序结果的可靠性, 在PCR及测序实验中均应用了具有3'→5'外切活性的高保真DNA聚合酶, 从而保证了实验结果的可信性.

备注

编辑: 张海宁

参考文献

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7.	成 军. 科学研究的设计和方法中的科学性. 世界华人消化杂志. 2004;12:1513-1516.  [PubMed]  [DOI]