HBV感染的外周血单个核细胞在母婴传播中的载体作用

摘要

目的: 探讨HBV感染的外周血单个核细胞(PBMC)在母婴传播中的载体作用.

方法: 选择血清HBV DNA(-)、PBMC HBV DNA(＋)孕妇分娩新生儿25例作为实验组, 乙肝标志物均为阴性孕妇分娩新生儿10例作为对照. 采用巢式PCR检测2组新生儿血清及PBMC HBV DNA; ELISA检测血清HBsAg; SP法检测PBMC中HBsAg.

结果: 实验组血清HBsAg均阴性, HBV DNA(＋)4例; PBMC HBsAg(＋)6例, HBV DNA(＋)6例, 其中有2例血清和PBMCHBV DNA均为阳性, 4例仅PBMCHBV DNA(＋), ２例仅血清HBV DNA(＋). 对照组血清及PBMC HBV DNA和HBsAg均阴性.

结论: HBV感染的外周血单个核细胞可作为母婴传播的载体.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2004
Revised: June 9, 2004
Accepted: July 11, 2004
Published online: September 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

母婴垂直传播是乙型肝炎病毒(HBV)传播的重要方式. 近年来, 随着乙肝疫苗和高效乙肝免疫球蛋白的应用, 使新生儿的感染率明显下降, 但仍有部分新生儿存在HBV感染[1]. 已有研究证实外周血单个核细胞是HBV的易感细胞, 也是HBV肝外寄生和复制的重要场所. HBV感染者的外周血单个核细胞中可检测到HBsAg, HBeAg和HBV DNA共价闭合环状DNA (cccDNA) 的存在[2-6] 甚至在血清HBsAg消失后产生了anti-HBs的患者的PBMC中HBV DNA, HBV RNA和共价闭合环状DNA (cccDNA)持续存在达数年之久[7-8], 慢性乙肝患者PBMC内 HBV DNA的阳性率为70-93%, 急性乙肝患者为50-80%左右[4]. 曾感染过乙肝现已恢复者PBMC内 cccDNA的阳性率为50%, HBV RNA的阳性率为100%[9] . 因此, 这类细胞在抗HBV病毒感染过程中又可能成为病毒藏匿、复制的场所及进一步传播的媒介. 为探讨母亲HBV感染的PBMC在垂直传播中的作用, 我们用巢式PCR (nested-PCR, n-PCR) 法检测出血清HBV-DNA(-), PBMC HBVDNA(+)母亲, 观察其分娩新生儿血清、PBMC内HBV-DNA和HBsAg的情况.

1 材料和方法

1.1 材料

2003-07/2004-03西安交通大学第一医院和省医院住院血清HBV DNA(-), PBMC HBV DNA(+)孕妇及其分娩的新生儿25例, HBsAg(-)10例, 其中anti-HBs(+), anti-HBc(+)2例; anti-HBs(+), anti-HBe(+)l例; anti-HBs(+), anti-HBe(+), anti-HBc(+)6例; anti-HBc(+)1例. HBsAg(+), anti-HBe(+), anti-HBc(+)者15例. 年龄24-36(平均28.5)岁. 乙肝标志物均为阴性的同期在两医院分娩的孕妇及其新生儿10例为正常对照. 所有病例均无肝炎症状及体征, 无先兆流产、早产及妊高征. 各组间孕妇年龄、孕产次及分娩时胎龄无显著差异(P >0.05).

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和处理: 分娩时无菌采集产妇静脉血5 mL, 新生儿接种HBVac和肌注HBIG前采集静脉血 5 mL, 2 mL不抗凝留取血清, 3 mL肝素抗凝分离PBMC, 于抽血后2 h内用比重1.077的淋巴细胞分离液常规分离PBMC. 用Hanks液洗涤5次, 保留最后一次上清100 mL, 以排除血清HBV DNA的污染. 吸取一部分细胞70%丙酮固定, 甩片做免疫组化. 将PBMC浓度调整至6×10⁴, -80℃冰箱保存统一检测.

1.2.2 HBV DNA的检测: 采用n-PCR, 引物依HBV基因组相对保守的S区设计, 由中国科学院上海细胞生物学研究所合成. 引物序列为: 外引物P₁ 5'-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3'(300-321), P₂ 5'-AGGGTTTAAATGTATACCC-3'(715-695), 内引物P₃ 5'-TCTATGTTTCCCTCTTGTTGC-3'(421-441), P₄ 5'-TACCACATCATCCATATAACTG-3'(626-605) 第1次扩增总反应体积50 mL, 无菌去离子水26 mL, 10×buffer (含Mg²⁺ 浓度为20 mmol/L) 5 mL, dNTPs (100 mmol/L) 4 mL, P1, P2各2 mL(终浓度0.2 mmol/L), 待测模板10 mL振荡混匀后, 加入Taq酶1 mL(2 U), 最后加入石蜡油50 mL封顶 94 ℃预变性180 s, 94 ℃变性50 s, 55 ℃退火50 s, 72 ℃延伸60 s, 72 ℃延伸300 s. 共30循环进行PCR扩增. 第2次扩增总反应体积50 mL, 无菌去离子水34 mL, 10×Buffer (含Mg²⁺ 浓度为20 mmol/L) 5 mL, dNTPs (100 mmol/L) 4 mL, P3, P4各2 mL (终浓度0.2 mmol/L), 第1次PCR扩增产物2 mL混匀后, 加入Taq酶1 mL(2 u), 最后加入石蜡油50 mL后进行PCR扩增. 反应条件同第1次PCR反应条件. 将扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg/ L)上电泳(电压5 V/cm)后, 紫外灯下观察, 第1次扩增产物于分子大小为416 bp处有明确荧光带者判为阳性(强阳性), 第2次扩增产物于分子大小为206 bp处有明确荧光带者判为阳性(弱阳性), 2次扩增均阴性则判断为阴性, 每次试验均设阳性, 阴性及空白对照.

1.2.3 PBMC HBsAg的检测: 用SP法, 鼠抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体购自上海长岛公司、SP(二抗)试剂盒购自购于福州迈新公司. 以乙型肝炎患者的肝组织标本为阳性对照. (1)水化20 min. (2)0.5% TritonX-100破膜20 min. (3)H₂O₂封闭内源性过氧化物酶37 ℃ 20 min; (4)正常山羊血清封闭非特异性蛋白37 ℃ 30 min; (5)鼠抗人HBsAb (1:100), 空白对照以PBS替代, 4℃过夜后37 ℃复温40 min; (6)生物素化山羊抗小鼠I g G(二抗) 37 ℃ 30 min, (7)SP复合物37 ℃ 30 min, 以上各步之后以PBS (0.01 mol/L, pＨ7.4) 洗5 min×3次; (8)DAB镜下控制显色, 苏木精复染30 s, 脱水, 透明, 中性树胶封片显微镜下观察.

1.2.4 血清HBsAg的检测: 采用ELISA法, 试剂盒购自厦门毕恩生物技术有限公司, 严格按说明书操作.

2 结果

2.1 血清 HBsAg测定

实验组和对照组血清 HBsAg均阴性.

2.2 PBMC HBsAg测定

实验组4例PBMC HBsAg阳性(表1), H BsAg棕黄色阳性信号出现在单核细胞和淋巴细胞的胞质(图1B), 细胞分布的频率以单核细胞为主, 其次是淋巴细胞.对照组PBMC 内无棕黄色颗粒.(图1A).

表1 新生儿宫内感染与母亲HBV感染状态的关系.

No.	母亲血清HBV标志				母亲HBV DNA		生儿HBsAg		新生儿HBV DNA
	HBs Ag	anti-HBs	anti-HBe	anti-HBc	血清	PBMC	血清	PBMC	血清	PBMC
1	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
4	-	+	+	+	-	+	-	+	-	+
7	-	+	+	+	-	+	-	+	+	+
10	-	+	-	+	-	+	-	-	+	-
13	+	-	+	+	-	+	-	+	-	+
14	+	-	+	+	-	+	-	-	+	+
16	+	-	+	+	-	+	-	-	+	-
24	+	-	+	+	-	+	-	+	-	+

图1 外周血单个核细胞中HBsAg表达SP×400. A: 正常对照组; B: 实验组.

2.3 血清及PBMC HBV DNA测定

实验组新生儿血清HBV DNA(+)4例, PBMC HBV DNA(+)6例, 其中血清和PBMC HBV DNA双阳性2例, 仅PBMC HBV DNA(+)4例, 仅血清HBV DNA(+)２例. (表1). 对照组血清和PBMC HBV DNA均阴性.

3 讨论

PBMC不但可以从外周血摄取HBVDNA而且HBV可以在PBMC中复制. 本研究中, PBMC HBsAg的阳性率以单核细胞最高, 其次是淋巴细胞, 这与以往的研究结果一致. 宋闽宁 et al[10]体外用植物血凝素(PHA)刺激慢性乙肝病毒携带者PBMC, 在其培养的上清中用荧光定量PCR检测到HBV DNA. 本研究中, 仅PBMC HBV DNA(+)母亲所分娩新生儿中有4例血清HBV DNA(+). 表明PBMC可以作为HBV转录和翻译的场所, 产生并释放具有感染性的完整的病毒颗粒, 引起HBV感染. 本研究中, 2例新生儿血清和PBMC HBV DNA(+)PBMC HBsAg(+)而血清HBsAg(-), 2例PBMC HBV DNA(+)而PBMC HBsAg(-)可能是因为: (1)病毒复制水平相对较低.n-PCR法可检测出1-3copy/mL, 而ELISA方法检测出HBsAg , HBV-DNA必须大于/等于3×10^7-9copy/mL.(2)病毒基因S区变异影响HBsAg表达或改变HBsAg立体构象而不能检出. 且绝大多数错义变异位于T, B淋巴细胞表位内或(和)其附近[11], (3)HBV整合到宿主染色体中:HBV DNA的整合可导致病毒DNA序列重排, 进而影响HBsAg表达[12]. PBMC具有变形游走特性, 可在组织间隙内自由移动;妊娠期和分娩期绒毛断裂也可使少量母体白细胞通过胎盘屏障. Lo et al[13] 和Bauer et al[14]在脐血中检测到母亲PBMC. 本研究中, 实验组新生儿血清HBV DNA(+)4例, PBMC HBV DNA(+)6例, 我们同时在新生儿外周血单个核细胞中检测到HBsAg. 从而证明HBV感染的PBMC可作为一个载体引起HBV母婴传播. 我们推测仅新生儿PBMC HBV DNA(+)的机制可能在正常妊娠过程中通过完整的胎盘或分娩过程中母血经渗漏至胎儿血循环. 新生儿仅血清HBV DNA(+)的机制, 推测可能是PBMC中的HBV在胎盘处复制并感染胎盘进入新生儿血液循环. 孕期多次注射乙肝免疫球蛋白或联合乙肝疫苗可有效降低血清HBV感染率, 但对PBMC中的HBV的感染无效[15] . 因此,要进一步降低HBV母婴传播率必须探索降低PBMC HBV感染率的方法.

备注

$[Footnotes]

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