基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-09-15; 12(9): 2119-2122
在线出版日期: 2004-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i9.2119
依那普利对大鼠肝纤维化的预防和治疗作用
柳怿, 李继强
柳怿, 李继强, 上海市消化疾病研究所, 上海第二医科大学附属仁济医院消化科 上海市 200001
柳怿, 女, 1973-10-19生, 上海市人, 汉族. 1996年上海第二医科大学本科毕业, 现为上海第二医科大学在读博士研究生. 主要从事肝脏疾病的研究.
通讯作者: 李继强, 200001, 上海市山东中路145号, 上海市消化疾病研究所, 上海第二医科大学附属仁济医院消化科. leejiqiang@21cn.com
电话: 021-63200874 传真: 021-63266027
收稿日期: 2004-05-07
修回日期: 2004-06-09
接受日期: 2004-06-24
在线出版日期: 2004-09-15

目的: 探讨血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)依那普利(Ena)对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠实验性肝纤维化的预防和治疗作用.

方法: 以CCl4诱导形成大鼠肝实质损伤性肝纤维化模型. 大鼠分为对照组、模型组、预防组及治疗组. 除对照组外, 其余各组大鼠均sc 400 mL/L CCl4橄榄油混合液, 每3 d/次, 共10 wk. 预防组同时给予Ena灌胃. 治疗组则在造模第5 wk给予Ena灌胃. 实验结束后称量肝脾并收取肝组织. 通过HE及Masson三色染色对肝组织炎症及纤维化程度进行评价, 通过透射电镜观察肝细胞超微结构.

结果: 用药后, 与对照组相比, 模型组、Ena预防及治疗组体质量均显著下降(P <0.01). 与模型组相比, Ena预防及治疗组大鼠肝脾指数均显著降低(P <0.01), Ena高剂量预防及高剂量治疗组均显著改善肝组织炎症和纤维化程度(P <0.01). 通过电镜观察肝细胞, Ena高剂量预防及高剂量治疗组肝细胞损害较模型组明显减轻.

结论: 依那普利对CCl4诱导的大鼠实验性肝纤维化有良好的预防和治疗作用.

关键词: N/A
引文著录: 柳怿, 李继强. 依那普利对大鼠肝纤维化的预防和治疗作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(9): 2119-2122
Preventive and therapeutic effects of enalapril on liver fibrosis in rats
Yi Liu, Ji-Qiang Li
Yi Liu, Ji-Qiang Li, Shanghai Institute of Digestive Disease, Shanghai Second Medical University Renji Hospital, Shanghai 200001, China
Correspondence to: Dr. Ji-Qiang Li, Shanghai Institute of Digestive Disease, 145 Shandong Middle Road, Shanghai 200001, China. leejiqiang@21cn.com
Received: May 7, 2004
Revised: June 9, 2004
Accepted: June 24, 2004
Published online: September 15, 2004

AIM: To study the effects of angiotensin-converting enzyme inhibitor, enalapril, on the extent of liver fibrosis in experimental fibrotic rats induced by carbon tetrachloride (CCl4).

METHODS: Liver fibrosis in rats was induced by CCl4. Rats were assigned into control group, model group, prevention groups and treatment groups. Except for rats in control group, all rats were given subcutaneous injection of 400 mL/L CCl4, once every 3 days for 10 weeks. Rats in prevention groups were also given enalapril via gastrogavage. But rats in treatment groups were given enalapril from the fifth week to the end via gastrogavage. At the end of tenth week, livers and spleens were measured and specimens of liver were stored. The extent of liver inflammation and fibrosis was evaluated with HE and Masson staining. We also observed the ultrastructures of hepatocytes under electron microscope.

RESULTS: After using enalapril, the body weights of model group, enalapril prevention groups and enalapril treatment groups decreased significantly as compared with that of control group (P <0.01). Compared with model group, the liver and spleen indexes of enalapril prevention and treatment groups decreased significantly (P <0.01), enalapril prevention and treatment groups of higher dose considerablely attenuated the extent of liver inflammation and fibrosis (P <0.01). The extent of hepatotic injury in enalapril prevention and treatment groups of higher dose decreased significantly than that of model group under electron microscope.

CONCLUSION: Enalapril has better preventive and therapeutic effects on experimental liver fibrosis in rats induced by CCl4.

Key Words: N/A
0 引言

近年研究证实, 肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)抑制剂抗纤维化作用的主要机制在于阻断血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)对纤维母细胞的直接促增生、促细胞外基质(ECM)分泌效应, 同时消除AngⅡ对纤维母细胞转化生长因子-b(TGF-b)自分泌的正调控作用[1-9]. 抑制RAS活性可显著抑制心肌、肾脏及肺间质纤维化的发生[10-17] . 而肝纤维化的发生也可能与组织局部RAS激活有关, 血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)依那普利(enalapril, Ena)可能对肝纤维化有预防和治疗作用.

1 材料和方法
1.1 材料

♂SD大鼠110只, 体质量210±15 g, 购于中国科学院实验动物中心. 400 mL/L CCl4用精制橄榄油配制(体积比: CCL4/橄榄油=2/3). Ena为默沙东(美国)医药公司产品.

1.2方法

大鼠随机分为对照组, 模型组, Ena高、低剂量预防组(每日10 mg/kg、5 mg/kg), Ena高、低剂量治疗组(剂量同上).对照组10只, 其余各组每组20只. 模型组、Ena预防及治疗组大鼠sc 400 mL/L CCl4 (3 mL/kg体质量, 每3 d/次, 共10 wk, 首剂加倍). 对照组大鼠注射等体积的精制橄榄油. 预防组给予Ena灌胃, 1次/d, 至造模结束, 共10 wk. 治疗组则从纤维隔初步形成时(造模5 wk)给予Ena灌胃, 1次/d, 至造模结束, 共6 wk. 对照组和模型组灌以等剂量的生理盐水. 肝组织标本固定于40 g/L中性甲醛, 石蜡包埋, 4 mm厚连续切片, 常规HE、Masson三色染色. 另取小块肝组织经25 g/L戊二醛固定, 制成超薄切片, 铅铀双染色, 通过日本产H-800透射电镜观察肝细胞超微结构. 依据2000年西安全国肝病会议通过的标准, 将肝炎病变依炎症活动度及纤维化程度分别分为1-4级和1-4期, 前者又将汇管区及汇管区周围炎症(界面炎)与小叶内炎症分为两项, 分别按程度定级, 当两项的程度不一致时, 总的炎症活动度以高者为准, 具体见文献[18]报道.

统计学处理 采用SAS8.0软件进行统计学分析. P <0.05为差异有显著性. 计数资料用校正χ2检验进行统计. 计量资料用配对t检验及单因素方差分析进行统计. Ena对大鼠肝组织炎症及纤维化程度的影响用按等级分组资料的秩和检验(Kruskal-Wallis Test)进行统计.

2 结果
2.1 大鼠死亡率和体质量

模型组、Ena预防及治疗组之间死亡率差别无显著性意义(表1). 用药前各组体质量差别无显著性意义.用药前后各组体质量差别有显著性意义. 用药后, 与对照组相比, 模型组、Ena预防及治疗组体质量均显著下降(表1).

表1 Ena对CCl4大鼠死亡率和体质量的影响.
分组n死亡率n / n (%)体质量(mean±SD, g)
用药前用药后
对照100/10 (0)233.6±5.8b301.9±10.6
模型203/20 (15)234.0±6.2b267.1±10.3d
高剂量预防204/20 (20)232.2±5.7b249.8±9.6d
高剂量治疗205/20 (25)235.2±5.7b252.7±8.1d
低剂量预防203/20 (15)233.3±5.3b253.9±9.1d
低剂量治疗205/20 (25)233.0±5.4b262.1±8.1d
bP <0.01 vs用药后;
dP <0.01 vs用药后对照组.
2.2 大鼠肝脾指数

肝指数(%)=肝脏质量/体质量×100%.脾指数(%)=脾脏质量/体质量×100%.大鼠肝指数:对照组(3.1±0.2%), 模型组(4.3±0.4%), Ena高剂量预防组(3.3±0.2%), Ena高剂量治疗组(3.5±0.3%), Ena低剂量预防组(3.5±0.3%), Ena低剂量治疗组 (3.9±0.4%). 大鼠脾指数: 对照组(0.2±0.03%), 模型组(0.5±0.04%), Ena高剂量预防组(0.3±0.02%), Ena高剂量治疗组(0.3±0.04%), Ena低剂量预防组(0.3±0.02%), Ena低剂量治疗组(0.31±0.03%). 与模型组相比, Ena预防及治疗组肝脾指数均显著降低. 与Ena低剂量治疗组相比, Ena预防及高剂量治疗组肝指数均显著降低, Ena高剂量预防及高剂量治疗组脾指数均显著降低. 与对照组相比, 模型组及Ena低剂量治疗组肝脾指数均显著增加(图1).

图1
图1 CCl4大鼠肝脾指数比较. A: 肝指数比较; B: 脾指数比较.
2.3 肝组织HE和Masson三色染色

模型组肝组织炎症及纤维化程度明显, 表现为肝组织结构紊乱, 广泛肝细胞变性、坏死及弥漫的纤维间隔形成. Ena高剂量预防及高剂量治疗组肝组织炎症和纤维化程度较模型组显著减轻(图2). Ena高剂量预防及治疗组分别较低剂量预防及治疗组炎症和纤维化程度显著减轻(表2).

表2 Ena对CCl4大鼠肝组织炎症和纤维化程度的影响.
分组n炎症分期
平均秩和纤维化分级
平均秩和
0ⅠⅡⅢⅣ0ⅠⅡⅢⅣ
对照1010----8.510----5.5
模型17-258261.2-242963.0
高剂量预防163652-35.2bcd-861135.5bcd
高剂量治疗153542138.5e,g-823240.3e
低剂量预防17-376154.7-357251.7
低剂量治疗15-337260.0--56461.1
bP <0.01 vs 模型组;
cP <0.05 vs 低剂量预防组;
dP <0.01 vs 低剂量治疗组;
eP <0.05 vs 低剂量治疗组;
gP <0.05 vs 低剂量预防组.
图2
图2 大鼠肝组织Masson三色染色. A: CCl4肝纤维化组(10×10); B: 高剂量预防组(10×10); C: 高剂量治疗组(10×10).
2.4 电镜观察结果

正常肝细胞呈多面体, 细胞核为圆形或椭圆形, 核膜清晰, 胞质内有分布规律的内质网, 有散布的核糖体, 线粒体呈圆形或椭圆形. 模型组胞质内有大量脂滴, ECM中可见胶原纤维, 肝细胞核固缩、变形, 核膜模糊不清, 内质网溶解, 核糖体脱失, 线粒体肿胀、结构模糊、嵴减少. Ena高剂量预防及高剂量治疗组肝细胞损害明显减轻, 脂滴及胶原纤维明显减少, 线粒体膜性结构可见, 内质网存在, 但不如正常组规律(图3).

图3
图3 大鼠肝细胞电子显微镜. A: CCl4大鼠肝细胞(TEM×2 100); B: 高剂量预防组(TEM×3 800); C: 高剂量治疗组(TEM×3 800).
3 讨论

近年体外研究表明, 外源性AngⅡ可剂量依赖性地促进间质成纤维细胞增生, TGF-b分泌及ECM的表达[19-21]. 体内研究显示, RAS抑制剂对肺纤维化、心肌梗死后心肌间质纤维化及输尿管梗阻后肾间质纤维化等均具有良好的治疗作用[2,9,14-15,22-23]. 目前研究发现AngⅡ与肝纤维化之间亦存在着一定的联系, AngⅡ能促进活化肝星状细胞的收缩和增生, 促使ECM大量积聚, 并且能刺激TGF-b的大量表达, 在肝纤维化形成中起着重要作用[24-32]. Yoshiji et al[26-27]的研究表明ACEI苯那普利能预防肝纤维化的形成, 显著降低肝脏羟脯氨酸含量, 显著减少a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞的数目及a-Ⅲ型前胶原mRNA的表达量, 通过蛋白激酶C信号途径抑制基质金属蛋白酶抑制剂-1的表达. Jonsson et al [28] 的研究亦表明ACEI卡托普利能预防肝纤维化的形成, 减少TGF-b1和胶原基因的表达, 减轻胶原的沉积, 抑制基质金属蛋白酶-2和9的活性. 我们证实ACEI Ena能剂量依赖性地预防及治疗CCl4诱导的肝细胞损伤和肝纤维化, 提示AngⅡ是肝纤维化形成的一个重要递质. 在Yoshiji 和Jonsson et al的研究中, ACEI是在研究开始时给动物服用的, 即在肝纤维化形成之前给动物服用. 如要证明药物能有效应用于临床, 就必须说明服用药物也能延缓已经形成的肝纤维化的进展. 在本研究中, 自肝纤维化造模5 wk(纤维隔初步形成时)给大鼠服用Ena, 用药至造模结束时, HE和Masson三色染色显示Ena高剂量治疗组肝细胞空泡变性及炎症程度亦显著改善, 肝纤维化程度亦显著减轻. Ena高剂量治疗组肝组织炎症及纤维化程度和Ena高剂量预防组相近, 二组之间差别无显著性意义. 但高低剂量组间差别有显著性意义. 这表明Ena不仅能预防肝纤维化的形成, 而且能较有效地延缓已经形成的肝纤维化的进展. Ena预防和治疗肝纤维化呈剂量依赖性的特点.

Ena预防及治疗组肝脾指数较模型组显著降低, 这表明Ena能显著改善肝脾充血肿大, 减轻肝脾损伤. 同时从肝细胞超微结构看, Ena高剂量预防及高剂量治疗组肝细胞损害明显减轻, 细胞器结构较模型组清晰完整, 这从形态学上表明Ena有明显的保护肝细胞的作用. Ena预防及治疗组体质量比对照组显著下降, 比模型组亦略有下降, 可能与其拮抗醛固酮, 产生利尿作用有关. 模型组、Ena预防及治疗组之间死亡率差别无显著性意义, 这表明我们所用的Ena剂量是安全剂量, 未引起大鼠死亡率的明显增加. 综上所述, 我们认为Ena不仅能剂量依赖性地预防肝纤维化的形成, 而且能剂量依赖性地延缓已经形成的肝纤维化的进展. Ena能减轻肝脾损伤, 有明显的保护肝细胞的作用. Ena作为口服抗高血压药物在临床应用已有较长时间, 已被证实是一种较为安全的药物, 且副作用较小, 可能会成为治疗人类肝纤维化疾病的合适药物之一. 其详细的作用机制尚需深入探讨, 在临床的应用亦更需做大量的病例研究工作.

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